hUC-MSCs/hHGF基因修饰的hUC-MSCs移植在心肌损伤修复中的实验研究

摘要

目的:
　　 本实验选用广西巴马小型猪，通过外科手术建立急性心肌梗死模型，将体外培养的人脐带间充质干细胞(Human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)经心外膜植入心肌梗死区，观察hUC-MSCs移植对缺血性心肌损伤的修复作用并探讨其机制。同时比较人肝细胞生长因子（Human hepatocytegrowth factor，hHGF）基因修饰的hUC-MSCs移植与单纯的hUC-MSCs移植在同一急性心肌梗死模型中的心肌损伤修复作用有无差别并探讨其可能的机制。
　　 方法:
　　 无菌条件下采集足月儿的脐带后，hUC-MSCs经体外分离、培养、扩增至第五代。用携带hHGF基因的重组腺病毒基因表达载体以150的感染强度转染hUC-MSCs，获得hHGF基因修饰的hUC-MSCs。两种干细胞均在术前以CM-Dil标记备用。采用外科手术方法于中、远端1/3交界处结扎冠状动脉前降支制成小型猪急性心肌梗死模型。随机将实验动物分为4组，每组6只。A组空白对照组（只造模而不做任何干预）;B组PBS组;C组hUC-MSCs移植组;D组hHGF基因修饰的hUC-MSCs移植组。C组与D组中每只动物分别接受总计2×107的hUC-MSCs或hHGF基因修饰的hUC-MSCs，分成9-10个点经心外膜注入梗死后缺血的心肌;PBS组则注入同等体积的无菌PBS。6周后，采用静息核素心肌灌注显像与经胸超声心动图评价梗死区血流灌注与局部收缩功能的变化。实验动物处死后采集梗死区域的心肌标本，采用RT-PCR、免疫荧光与免疫组化、Masson和TUNEL染色的方法观察干细胞的植入、增殖及分化，血管新生，存活心肌、细胞凋亡的情况，以揭示可能的作用机制。
　　 结果:
　　 (1)术后6周与空白对照组和PBS组相比，hUC-MSCs移植组与hHGF基因修饰的hUC-MSCs移植组经静息核素心肌灌注显像检测的灌注质量缺损百分率变化显著改善(P＜0.001);经胸超声心动图观察到的局部梗死区室壁舒张末期厚度与收缩期增厚率显著改善(P＜0.001)。免疫荧光检查发现hUC-MSCs与hHGF基因修饰的hUC-MSC这两种干细胞移植后6周，原梗死区域仍可见所移植的干细胞存活，其中部分向心肌和血管内皮细胞分化。同时亦可见固有心脏干细胞的募集与分化。与空白对照组和PBS组相比，hUC-MSCs移植组与hHGF基因修饰的hUC-MSCs移植组的vWF免疫组化染色结果显示新生血管密度显著增加(P＜0.001)，Masson染色结果显示存活心肌明显增多而纤维组织明显减少(P＜0.001)，TUNEL染色结果显示细胞凋亡明显减少(P＜0.001)，血管内皮生长因子（Vascularendothelial growth factor, VEGF）、肝细胞生长因子（Hepatocyte growthfactor，HGF）、转化生长因子β3(Transforming growth factor-β3，TGF-β3)、血管性血友病因子（Von Willebrand Factor, vWF）、基质细胞衍生因子（Stromal cell-derived factor-1，SDF-1）和CXC族细胞因子受体4（CXC chemokine receptor4，CXCR4）mRNA的表达明显上调(P＜0.001)。
　　 (2)干细胞移植后6周，hUC-MSCs移植组与hHGF基因修饰的hUC-MSCs移植组经静息核素心肌灌注显像检测的灌注质量缺损百分率变化和经胸超声心动图观察到的局部梗死区室壁舒张末期厚度与收缩期增厚率之间的差别均无统计学意义(P＞0.05)。但是与hUC-MSCs移植组相比，hHGF基因修饰的hUC-MSCs移植组在局部缺血心肌中HGF的mRNA的表达明显上调（P＜0.05），vWF免疫组化染色结果显示新生血管密度显著增加(P=0.011)，Masson染色结果显示存活心肌明显增多(P=0.007)。
　　 结论:
　　 (1)hUC-MSCs与hHGF基因修饰的hUC-MSCs，经心外膜直接注射植入后可在小型猪急性心肌梗死模型的梗死区域内部分存活并分化为心肌和血管组织，同时也促进了固有心脏干细胞的募集和分化;可能通过外源性和内源性再生以及旁分泌三个方面的机制参与心梗后心肌与血管的新生，同时减少细胞凋亡和心肌纤维化，提高心肌存活和抑制心室重塑，改善梗死后心肌灌注和心室功能。
　　 (2)与单纯的hUC-MSCs移植疗法相比，hHGF基因修饰的hUC-MSCs移植疗法具有更强的促进血管新生和保护存活心肌的能力。以干细胞为基础的血管新生基因疗法将成为治疗严重缺血性心血管疾病的新策略。

目录

声明

摘要

缩略语／符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、hUC-MSCs移植在心肌损伤修复中的实验研究

1．1 对象和方法

1．1．1 主要实验材料

1．1．2 主要实验设备

1．1．3 实验方法

1．2 结果

1．2．1 hUC-MSCs细胞形态学观察

1．2．2 hUC-MSCs细胞表面标记检测

1．2．3 hUC-MSCs诱导向骨、脂肪、软骨细胞分化

1．2．4 动物存活评价

1．2．5 静息核素心肌灌注显像

1．2．6 经胸超声心动图

1．2．7 RT-PCR半定量分析结果

1．2．8 新生血管密度分析结果

1．2．9 心肌细胞存活的评价结果

1．2．10 心肌细胞凋亡的评价结果

1．2．11 干细胞存活、分化及增殖情况

1．3 讨论

1．3．1 hUC-MSCs促进外源性心肌与血管再生

1．3．2 hUC-MSCs促进内源性心肌与血管再生

1．3．3 hUC-MSCs的旁分泌机制对心肌损伤的修复作用

1．3．4 hUC-MSCs抑制心室重塑改善心脏功能

1．4 小结

二、hHGF基因修饰的hUC-MSCs移植在心肌损伤修复中的实验研究

2．1 对象和方法

2．1．1 主要实验材料

2．1．2 主要实验设备

2．1．3 实验方法

2．2 结果

2．2．1 hUC-MSCs细胞形态学观察、表面标记检测与诱导分化

2．2．2 GFP基因转染hUC-MSCs的检测与基因修饰后HGF的表达

2．2．3 Ad-HGF转染后hUC-MSC的表型分析

2．2．4 动物存活评价

2．2．5 静息核素心肌灌注显像

2．2．6 经胸超声心动图

2．2．7 RT-PCR半定量分析结果

2．2．8 新生血管密度分析结果

2．2．9 心肌细胞存活的评价结果

2．2．10 心肌细胞凋亡的评价结果

2．2．11 干细胞存活、分化及增殖情况

2．3 讨论

2．3．1 治疗性血管新生与肝细胞生长因子

2．3．2 干细胞治疗和基因治疗的有效结合

2．3．3 hUC-MSCs经HGF基因修饰后能更有效地促进心肌损伤的修复

2．4 小结

全文结论

论文创新点

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述一 脐带间充质干细胞生物学特性的研究进展

综述二 沃顿胶体干细胞的生物学特性及在心血管领域的研究进展

致谢