椒目质量标准研究及椒目脂肪酸SFODLPME–GC测定方法的建立

摘要

目的：
　　通过研究椒目的质量及其质量控制方法，制订有效评价椒目质量的山西省地方标准，为椒目药材质量控制提供科学依据；建立一种绿色、快速的样品前处理技术——漂浮有机液滴凝固液相微萃取(solidification of floating organic liquid-phase microextraction，SFODLPME）联合气相色谱（gas chromatography，GC）的测定方法，测定椒目中油酸、亚油酸、α-亚麻酸、棕榈酸及硬脂酸的含量，为多指标控制椒目质量提供一定的参考依据，也为中药脂肪酸的测定提供一种新的方法。
　　方法：
　　1.本课题采用常规的生药鉴别方法，查阅《中国植物志》、《中国高等植物图鉴》、《中药大辞典》等有关专著，对收集的10批椒目药材进行了基源鉴别、性状鉴别、显微鉴别及薄层鉴别，建立了椒目的定性鉴别方法。
　　参照2010版《中国药典》（一部）附录和2015版《中国药典》第四部通则相关方法，对椒目药材进行常规的检查，包括杂质、水分、灰分、酸不溶性灰分、重金属、砷盐及醇溶性浸出物，并制订椒目杂质、水分、灰分、酸不溶性灰分及醇溶性浸出物的限度。
　　采用单因素实验，比较了索氏法与超声法提取脂肪油的提取率，考察了溶剂、料液比、提取时间，优化了提取脂肪油的工艺，建立了椒目脂肪油的最佳提取方法；优化了椒目脂肪酸甲酯化的条件；对色谱柱类型、柱温、检测器温度及进样口温度进行了考察，建立了α-亚麻酸的GC测定方法，测定了10批椒目中α-亚麻酸的含量；制订了脂肪油及α-亚麻酸含量的限度，建立了椒目的定量研究方法。
　　2.对SFODLPME的各项参数进行优化，即有机溶剂的体积、盐浓度、搅拌速度、萃取时间、供相体积，筛选出最佳的微萃取条件，优化了色谱条件，建立SFODLPME–GC的含量测定方法，同时测定椒目中油酸、亚油酸、α-亚麻酸、棕榈酸、硬脂酸的含量，并对 SFODLPME-GC法与传统液液萃取(Liquid- liquid extraction，LLE）-GC法α-亚麻酸的测定结果进行了比较。
　　结果：
　　1.本课题组收集的10批椒目均为芸香科植物花椒Zanthoxylum bungeanum Maxim.的干燥成熟种子。卵圆形或类圆形，直径3～5 mm，表面具黑色光泽，外皮常脱落，脱落后呈网状灰棕色或棕黑色纹理，富油性，气香，味辛辣，为其性状特征。以种皮表皮细胞、石细胞、内种皮细胞（下皮细胞）、胚乳细胞、油滴等为主要显微特征。采用硅胶G薄层板，以α-亚麻酸和椒目对照药材为对照，以环己烷-乙酸乙酯-乙酸（10:1:0.1）为展开剂，以1％硫酸香草醛溶液为显色剂，105℃显色后，在日光下检视，斑点清晰，重现性好。建立了椒目药材质量标准的性状鉴别项、显微鉴别项和薄层鉴别项。
　　脂肪油提取工艺优选的条件为：采用超声提取法，以石油醚为溶剂，料液比为1:8，超声提取30 min。α-亚麻酸甲酯化优选的条件为：0.5 mol·L-1氢氧化钾甲醇溶液1 mL，60℃水浴加热30 min；14%三氟化硼甲醇溶液1 mL，60℃水浴加热20 min。建立椒目α-亚麻酸含量的GC测定方法：采用聚乙二醇20000（PEG-20M）毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.5μm），在柱温为190℃，检测器温度为250℃，进样口温度为250℃的条件下，α-亚麻酸得到较好的分离；含量测定方法学研究表明，α-亚麻酸在0.3046～12.1840 mg·mL-1浓度范围内呈良好的线性关系，回归方程为Y=0.4871X+0.0015，r=0.9999（n=6），平均回收率为100.65%。
　　10批椒目药材样品的杂质含量1.08%～5.82%，含水量9.66%～11.55%，灰分含量5.13%～6.51%，酸不溶性灰分含量0.11%～0.56%，重金属均在百万分之十以下，砷盐均在百万分之二以下；以干燥品计，椒目中浸出物含量16.77%～24.80%，脂肪油含量19.82%～28.08%，α-亚麻酸含量4.06%～6.56%。
　　按照中药质量标准限度制定原则，即最大（小）值±10%，提出了椒目质量标准中杂质含量不得过3%，水分含量不得过12.7%，总灰分含量不得过7.2%，酸不溶性灰分含量不得过0.6%；浸出物含量不得少于15.1%，脂肪油含量不得少于17.84%，α-亚麻酸含量不得少于3.65%。建立了椒目质量标准的检查项和含量测定项。
　　建立了椒目药材的山西省地方标准（已审核）及标准草案。
　　2. SFODLPME条件优化结果：萃取溶剂正十二醇体积20μL，盐浓度为10%，搅拌速度为700 r/min，萃取时间为20 min，供相体积为6.0 mL。建立了SFODLPME-GC的测定方法，采用聚乙二醇20000（PEG-20M）毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.5μm），程序升温，起始温度170℃，以5℃/min速率升至190℃，保持10 min，再以5℃/min升温至210℃，保持10 min，进样口温度为250℃，FID检测器温度为250℃。含量测定方法学验证结果表明：油酸、亚油酸、α-亚麻酸、棕榈酸、硬脂酸依次在8.37～99.12μg·mL-1、8.60～135.84μg·mL-1、1.62～161.68μg·mL-1、10.17～160.64μg·mL-1、10.13～120.00μg·mL-1的浓度范围内呈良好的线性关系，检出限1.2～1.6μg·mL-1；日内精密度RSD＜6.43%；日间精密度RSD＜9.61%；椒目五个脂肪酸的回收率在90.18%～109.14%。
　　3批椒目药材的含量测定结果：油酸含量为4.31%～5.52%，亚油酸含量为3.32%～5.36%，α-亚麻酸含量为6.72%～7.81%，棕榈酸含量为2.20%～3.41%，硬脂酸含量为0.22%～0.23%。
　　对SFODLPME-GC法与传统LLE-GC法的椒目α-亚麻酸的测定结果进行了统计学比较，按α＝0.05水准，P＞0.05，表明两种方法没有显著性差异，SFODLPME-GC法可用于椒目脂肪酸的测定。
　　结论：
　　1.通过对10批不同产地的椒目药材进行了基源鉴别、性状鉴别、显微鉴别、薄层鉴别、常规检查及含量测定等的研究，制订了椒目药材的山西省质量标准。该研究建立的方法具有良好的准确性、专属性和可行性，为椒目药材的质量控制和用药安全提供科学依据。
　　2. SFODLPME–GC法具有有机溶剂用量少，对待测组分的富集效果明显，且集分离、纯化、浓缩于一步的优点，可用于椒目脂肪酸的测定，且为多指标控制椒目质量提供参考依据，也为中药脂肪酸的测定提供一种新方法。

目录

声明

前言

第一章 椒目药材的鉴别

1 材料与方法

2 结 果

3 讨 论

4 结 论

第二章 椒目药材的常规检查

1 材料与方法

2 结 果

3 讨 论

4 结 论

第三章 椒目脂肪油及α-亚麻酸的测定

1 材料与方法

2 结 果

3 讨 论

4 结 论

第四章 漂浮有机液滴凝固液相微萃取条件优化

1 材料与方法

2 结 果

3 讨 论

4 结 论

第五章 SFODLPME-GC法测定椒目五个脂肪酸

1 材料与方法

2 结 果

3 讨 论

4 结 论

参考文献

综述:椒目脂肪酸的研究方法及其生物活性

致谢

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