电针通过激活前扣带皮层神经元δ阿片受体缓解大鼠的痛情绪反应

摘要

目的：
　　根据国际疼痛研究会（IASP）对疼痛定义，疼痛可分为两种成分，即痛的感觉分辨（sensory-discriminative）与痛的情绪反应（emotional-affective dimensions）。痛的感觉分辨感受痛刺激的性质、强度和位置等属性；痛的情绪反应包括焦虑、厌恶、恐惧等不良情绪。大量研究表明，疼痛的感觉成分和情绪反应是由不同的中枢机制作用产生，并且由不同的神经传导通路介导。人类和动物的行为学、电生理学和脑成像等相关治疗、实验结果已提供证据，位于大脑额叶内侧的前扣带皮层（anterior cingulate cortex，ACC），尤其是其吻侧部（rostral ACC，rACC）参与疼痛诱发的厌恶情绪的形成，在不良情绪引起的行为表现等方面起着重要作用。切除大鼠双侧的 rACC可以避免痛情绪引起的条件性位置回避（conditioned place avoidance，CPA）。一些临床和动物实验的研究也表明，电针刺激可以缓解人和动物的痛情绪反应；而已有的资料和我们过去的工作显示，传统的中医针灸或现代的电针治疗可激活体内的阿片受体缓解疼痛。阿片受体主要有3型：μ-阿片受体、δ-阿片受体、κ-阿片受体。我们之前的研究已经证实电针可通过激活μ-受体缓解大鼠的痛情绪，但是否能通过激活δ-阿片受体缓解痛情绪并不清楚，本研究就此进行深入探讨。
　　本实验使用的动物模型为大鼠脚掌注射完全弗氏佐剂(complete Freund’s adjuvant，CFA）诱导的条件性位置回避（C-CPA）模型，结合在rACC脑区内分别给予不同浓度δ-阿片受体拮抗剂Naltrindole，测量C-CPA行为反应和热痛行为反应（热缩足反射潜伏期，PWL），探讨此实验中拮抗rACC内δ-阿片受体是否可以反转电针缓解痛情绪的作用。
　　方法：
　　1．建立由CFA诱导的慢性持续性炎性疼痛动物模型
　　取250-270g成年雄性SD（Sprague Dawley）大鼠，左侧足底皮下注射0.08ml完全弗氏佐剂（CFA），建立炎症性疼痛模型。对照组为左侧足底皮下注射0.08ml生理盐水（NS）组和足底未注射组。
　　2．建立由CFA诱导的条件性位置回避（C-CPA）模型
　　将实验大鼠随机分为3组：（1）足底未注射对照组；（2）足底注射生理盐水（NS）对照组；（3）足底注射CFA（0.08ml）实验组。n=6～8只/组。将由注射CFA引起的慢性炎症性疼痛作为特定的条件，并与可分辨的环境耦合，建立条件性位置回避（C-CPA）模型，比较大鼠脚掌注射CFA前后在“疼痛环境”中停留的时间，并计算回避分数（CPA Score），判断大鼠是否产生CPA反应。
　　3．电针刺激
　　取成年雄性 SD大鼠，随机分为真电针组（electroacupuncture，EA）和假电针组（sham EA）。在脚掌注射NS/CFA后，将针灸针插入大鼠双侧环跳穴（GB30），用胶带固定于大腿。通过导线将针灸针与电针仪相连，通电后开始电针刺激。
　　4．检测热缩足反射潜伏期（Paw Withdrawal Latency，PWL）
　　在CPA的第一天和第三天分别检测各组大鼠的PWL，观察CFA对大鼠的热痛行为反应的影响，以及rACC注射不同剂量naltrindole并给予电针刺激后大鼠PWL数值的变化。
　　5．通过western-blot检测δ-阿片受体和NR1/NR2A/NR2B亚基的磷酸化表达水平
　　在行为检测实验完成后，取大鼠rACC区组织样本，通过western-blot技术检测各组大鼠rACC区内δ-阿片受体和NR1/NR2A/NR2B亚基的磷酸化表达水平。
　　6．实验分组
　　根据左侧足底皮下注射CFA/NS、rACC区注射naltrindole/NS和双侧环跳穴真假电针刺激将大鼠分为以下8组。①足底注射NS，rACC注射NS，EA；②足底注射NS，rACC注射NS，sham EA；③足底注射CFA，rACC注射NS，EA；④足底注射CFA，rACC注射NS，sham EA；⑤足底注射NS，rACC分别注射1/2.5/5/10μg/μl naltrindole，EA；⑥足底注射NS，rACC分别注射1/2.5/5/10μg/μl naltrindole，sham EA；⑦足底注射 CFA，rACC分别注射1/2.5/5/10μg/μl naltrindole，EA；⑧足底注射CFA，rACC分别注射1/2.5/5/10μg/μl naltrindole， sham EA。
　　结果：
　　1．足底注射CFA，大鼠的热痛行为发生改变
　　大鼠左侧足底注射CFA组、注射NS组和未注射对照组比较，注射CFA组大鼠 PWL在处理后第三天与第一天基础值相比明显缩短（post7.23±1.65s VS pre12.54±0.72s，P＜0.05，n=6），注射NS组（post15.62±2.99s VS pre14.35±1.05s，P＞0.05，n=6）和未注射组（post13.66±2.22s VS pre14.27±1.05s，P＞0.05，n=6）的PWL与各自基础值相比，没有明显的变化。说明后脚掌注射CFA可引起大鼠炎症性疼痛。
　　2．足底注射CFA诱导大鼠产生CPA反应
　　足底未注射对照组（post275.18±34.35s VS pre324.83±34.35s，P＞0.05，n=6）和足底注射生理盐水组（post287.32±41.35s VS pre320.42±65.55s，P＞0.05，n=6），大鼠第三天在“疼痛环境”匹配室的停留时间和第一天相比都没有显著性差异，两组回避分数间没有差别（P＞0.05）。足底注射 CFA组（post193.83±69.4s VS pre315.3±34.6s，P＜0.05，n=6），大鼠第三天在“疼痛环境”匹配室停留的时间明显小于第一天，因而对环境产生厌恶反应。说明大鼠后脚掌注射CFA可引起CPA反应，即产生痛情绪。
　　3．电针刺激可缓解CFA诱导的大鼠条件性位置回避（CPA）反应
　　大鼠左侧足底注射CFA后，在双侧环跳穴分别给予真电针刺激（EA）或者假电针刺激（sham EA）。大鼠足底注射CFA，假电针刺激后，在“疼痛环境”停留的时间第三天明显少于第一天，有显著性差异，(post174.67±31.03s VS pre323.03±84.94s，P＜0.05，n=6）；真电针刺激后，大鼠在“疼痛环境”中停留时间第三天与第一天相比没有统计学差异，（post370.40±80.34s VS pre400.57±81.03s，P＞0.05，n=6）。真电针组（EA）回避分数明显小于假电针组（sham EA）,两组有统计学差异（EA组-77.23±35.58s VS sham EA组-148.4±31.15s，P＜0.05，n=6）。说明电针刺激可以缓解CFA诱导的CPA反应。
　　大鼠左侧足底注射NS后，在双侧环跳穴分别给予真电针刺激（EA）或者假电针刺激（sham EA）。两组大鼠在“疼痛环境”中停留时间第三天和第一天相比均没有统计学差异，假电针组（post306.63±30.25s VS pre309.8±35.62s，P＞0.05，n=6）；真电针组（post278.34±41.07s VS pre315.16±51.77s，P＞0.05，n=6）。两组回避分数相比也没有统计学差异(NS+EA组-30.67±6.36s VS NS+sham EA组12.33±1.86s，P＞0.05，n=6）。说明电针刺激不会引起正常大鼠的厌恶或者奖赏反应。
　　大鼠左侧足底注射CFA后，在双侧环跳穴分别给予真电针刺激（EA）或者假电针刺激（sham EA），第三天测量大鼠的热痛行为反应，PWL之间没有统计学差异，真电针组（post8.97±1.09s VS pre7.34±0.52s，P＞0.05，n=6）；假电针组（post8.53±0.86s VS pre7.63±0.26s，P＞0.05，n=6）。电针刺激双侧环跳穴不影响由CFA引起的大鼠慢性炎症性热痛行为。
　　4．rACC内注射δ-阿片受体拮抗剂naltrindole反转了电针刺激缓解痛情绪的作用
　　足底注射CFA，rACC内注射δ-阿片受体拮抗剂naltrindole或NS,不进行电针刺激。大鼠第三天在“疼痛环境”中停留时间与第一天相比：naltrindole组(post241.5±26.32s VS pre373.68±35.65s，P＜0.05，n=7）；NS组（post183.63±22.60s VS pre318.67±37.61s，P＜0.05，n=6）；naltrindole组和NS组回避分数没有统计学差异（-92.76±12.63s VS-70.42±11.80s，P＞0.05，n=6）。rACC内注射naltrindole本身不会影响大鼠的CPA反应。
　　足底注射CFA，rACC内注射δ-阿片受体拮抗剂naltrindole或NS,进行电针刺激。大鼠第三天在“疼痛环境”中停留时间与第一天相比：naltrindole组(post287.50±67.03s VS pre388.37±63.10s，P＜0.05，n=11）；NS组（post372.75±71.35s VS pre392.76±66.7s，P＞0.05，n=11）；naltrindole组回避分数明显大于NS组，有统计学差异（-100.90±s32.45 VS-20.01±26.53s，P＜0.05，n=11）。rACC内注射naltrindole反转了电针刺激缓解痛情绪的作用。
　　大鼠左侧足底注射CFA，rACC内注射不同浓度1/2.5/5/10μg/μlδ-阿片受体拮抗剂 naltrindole，进行电针刺激，不同浓度 naltrindole反转电针刺激缓解痛情绪的作用效果不同。大鼠在“疼痛环境”中停留的时间第三天与第一天相比：1μg/μl naltrindole组没有统计学差异（post304.6±40.3s VS pre293.0±25.28s，P＞0.05， n=11）；2.5μg/μl naltrindole组没有统计学差异(post284.3±62.62s VS pre375.3±28.0s，P＞0.05，n=8）；5μg/μl naltrindole组有统计学差异（post287.5±35.28s VS pre388.4±31.08s，P＜0.05，n=11）；10μg/μl naltrindole组有统计学差异（post252.0±29.46s VS pre319.1±12.24s，P＜0.05，n=11）。在rACC内注射1/2.5μg/μl naltrindole并未观察到反转电针缓解痛情绪的作用，在 rACC内注射5/10μg/μl naltrindole则反转了电针缓解痛情绪的作用。5μg/μl naltrindole反转电针缓解痛情绪作用更强，但与10μg/μl naltrindole的作用相比没有统计学差异。
　　大鼠左侧足底注射CFA，rACC内注射1/2.5/5/10μg/μl naltrindole的各组大鼠PWL值与rACC内注射NS相比，都没有显著性差异（P＞0.05）。各组PWL值为：CFA+NS组8.94±1.26s，n=7；CFA+1μg/μl naltrindole组9.22±1.15s，n=6；CFA+2.5μg/μl naltrindole组9.0±0.60s，n=8；CFA+5μg/μl naltrindole组10.36±1.44s， n=6；CFA+10μg/μl naltrindole组9.96±1.40s，n=6。rACC内注射naltrindole不影响CFA引起的热痛行为。
　　5．通过westerm-blot检测rACC内δ-阿片受体和磷酸化的NR1/NR2A/NR2B亚基的表达水平
　　大鼠足底注射 CFA，rACC内注射 NS，真电针刺激组（CFA+NS+EA），与足底注射CFA，rACC内注射NS，假电针刺激组（CFA+NS+sham EA）相比，rACC内δ-阿片受体表达量增多，有统计学意义（P＜0.05）。电针刺激可以激活大鼠rACC内的δ-阿片受体。
　　大鼠足底注射CFA，rACC内注射NS，假电针刺激组（CFA+NS+sham EA），与足底注射NS，rACC内注射NS，假电针刺激组（NS+NS+sham EA）相比，rACC内NR1/NR2A/NR2B亚基的磷酸化水平显著升高，有统计学意义（P＜0.05）。CFA致大鼠rACC内NR1/NR2A/NR2B亚基的磷酸化表达量增高。
　　大鼠足底注射 CFA，rACC内注射 NS，真电针刺激组（CFA+NS+EA），与足底注射CFA，rACC内注射NS，假电针刺激组（CFA+NS+sham EA）相比，rACC内NR1/NR2A/NR2B亚基的磷酸化水平显著降低，有统计学意义（P＜0.05）。大鼠电针刺激可以下调CFA诱导的rACC内NR1/NR2A/NR2B亚基的磷酸化表达。
　　结论：
　　1.电针刺激激活rACC内δ-阿片受体，从而缓解CFA诱导的痛情绪反应。
　　2.拮抗rACC内δ-阿片受体可反转电针刺激缓解CFA诱导的痛情绪反应，5/10μg/μl的naltrindole反转了电针缓解痛情绪的作用，而1/2.5μg/μl的naltrindole并未起到反转作用。
　　3.CFA致大鼠炎症性痛模型rACC内NR1/NR2A/NR2B亚基的磷酸化表达水平显著上调。
　　4.电针刺激可以激活rACC内的δ-阿片受体，下调NR1/NR2A/NR2B亚基的磷酸化表达水平，从而缓解痛情绪。

目录

声明

常用缩写词中英文对照表

前言

1 材料与方法

1.1实验动物及分组

1.2实验药品及主要试剂

1.3主要实验装置及仪器

1.4实验方法

1.5统计分析

2 结 果

2.1大鼠足底注射CFA可诱导产生条件性位置回避（CPA）反应

2.2电针刺激大鼠环跳穴可缓解CFA诱导的条件位置回避（CPA）反应

2.3电针刺激使炎性大鼠rACC内δ-阿片受体高表达

2.4 rACC内注射naltrindole可拮抗电针对CFA诱导的CPA的缓解作用

2.5电针刺激下调CFA所致的NR1/NR2A/NR2B亚基的磷酸化水平

3 讨 论

3.1电针刺激本身不会影响CPA反应

3.2电针刺激缓解痛情绪，但不影响痛感受

3.3电针刺激对rACC内δ-阿片受体和NR1/NR2A/NR2B亚基的磷酸化表达水平的影响

3.4 Naltrindole可以反转电针缓解痛情绪的作用

3.5 Naltrindole在一定剂量水平可以反转电针缓解痛情绪的作用

4 结 论

参考文献

综述:阿片受体在情绪障碍中的不同作用

致谢

个人简历