玉米核糖体失活蛋白基因z108在大肠杆菌中的表达及在烟草和番茄的转化研究

摘要

为进行抗病毒基因工程及玉米核糖体失活蛋白抗病机制研究，本实验室从玉米(ZeaMaysL)品种农大108胚芽中分离克隆得到了玉米核糖体失活蛋白基因z108，其开放阅读框为903个碱基对，编码蛋白301个氨基酸，与Bass(1995)发表的核苷酸序列的同源性为98.6％，是一个b-32-like基因。本研究将包含开放阅读框在内的玉米核糖体失活蛋白基因片段插入到大肠杆菌表达载体pET30a(+)的多克隆位点中，诱导其在大肠杆菌菌株BL21(DE3)中表达，并由农杆菌介导叶盘法转化烟草(Nicotiana.tobaccum.L)K326和番茄(LycopersiconesculentumMill)品种97-4、樱红(Lycopersiconesculentumvar.cerasiforme)，为今后开展抗病机制方面的研究奠定了坚实的基础。其研究结果如下：　　1)将包含开放阅读框在内的基因片段插入到大肠杆菌表达载体pET30a(+)的多克隆位点上，并转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)，37℃培养细菌至对数生长期以后，26℃诱导表达3h。SDS-PAGE电泳检测结果表明，玉米核糖体失活蛋白基因z108已在大肠杆菌菌株BL21(DE3)中获得表达，表达产物为一重组蛋白，分子量大小为52.1KD。这是国内首次在原核生物体中表达玉米核糖体失活蛋白基因及其编码蛋白。　　2)将玉米核糖体失活蛋白基因z108插入到双元载体pCambia1301的NcoI位点上，以根癌农杆菌EHA105为介导进行基因转化，分别在烟草和番茄中表达了该基因，在含有潮霉素的筛选培养基上，4个转化菌株pCam91-3-3、pCam92-11-3、pCam91-5-1和pCam92-6-1转化烟草的抗性不定芽分化率达到了57.45-62.79％，而不合有该基因的空载载体pCambia1301在烟草上的转化率75.34％；转化菌株pCam91-3-3在番茄品种樱红和97-4上的转化率分别达到了21.57％,22.67％，不含有该基因的空载载体pCambia1301在樱红和97-4上的转化率为23.08％，35.82％。　　3)根据已发表的基因序列，设计特异引物，随机对于烟草转化体91-3-3的5个植株进行PCR扩增，结果表明，5个转化体中均有插入基因序列的表达，这表明，经过潮霉素筛选的转化体植株均含有目标基因的插入。　　4)通过组织染色的方法对于表达基因进行Gus基因表达的检测，可以观察到，Gus基因可以在烟草转化体91-3-3的叶片的叶肉细胞和根毛细胞的内溶物中表达，而pCambia1301的烟草转化体，仅仅观察到了Gus基因在叶片表皮细胞的表达，由于目标基因的插入是与Gus基因紧密连锁的，z108和Gus基因构成融合基因，并且在35S启动子的调控之下，因此，Gus基因的表达，证实目标基因z108的组织表达具有特异性。

目录

文摘

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前言

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第一章、文献综述

1植物抗病毒基因工程研究进展

1.1病毒基因介导的抗病毒基因工程研究

1.2寄主基因介导的抗病毒基因工程研究

1.3病毒和寄主以外的基因介导的抗病毒基因工程研究

2核糖体失活蛋白研究进展及其应用

2.1核糖体失活蛋白的结构类型

2.2核糖体失活蛋白的功能及加工特点

2.3核糖体失活蛋白在植物抗病毒基因工程的应用

第二章、材料与方法

1材料

1.1植物材料

1.2菌种和质粒

1.3药品与主要试剂

2方法

2.1玉米核糖体失活蛋白在大肠杆菌中的表达

2.2农杆菌EHA105的转化及菌液的制备

2.3烟草的植株再生与基因转化

2.4番茄的植株再生与基因转化

2.5转基因植株的检测与分子鉴定

第三章、结果与分析

1玉米核糖体失活基因在大肠杆菌中的表达

1.1表达产物的诱导及分析

1.2表达产物的分离与纯化

1.3纯化蛋白的浓度测定及差异显著性分析

2玉米核糖体失活蛋白基因在烟草中的表达

2.1烟草的植株再生

2.2潮霉素筛选浓度的确定

2.3转化体的筛选与植株再生

3玉米核糖体失活蛋白基因在番茄中表达的研究

3.1番茄转化体系的建立

3.2潮霉素筛选浓度的确定

3.3农杆菌菌液浓度和侵染时间对番茄基因转化的影响

3.4转化体的筛选

4转基因植株的分子检测

4.1转基因烟草的分子鉴定

4.2烟草转基因植株的组织化学鉴定

附图

第四章、讨论

1玉米核糖体失活蛋白基因在大肠杆菌中获得表达

2玉米核糖体失活蛋白基因在烟草和番茄中获得表达

3影响外源基因在大肠杆菌中高效表达的因素

4番茄转化中存在的褐变问题

5预培养和共培养时间对番茄基因转化的影响

6本研究中基因转化的特点

7玉米核糖体失活蛋白基因表达的特点

第五章结论

1玉米核糖体失活蛋白基因z108在大肠杆菌BL21(DE3)中获得表达

2烟草K326和番茄品种樱红和97-4再生体系的建立

3烟草和番茄的基因转化

4烟草转化体的PCR检测

5烟草转化体的Gus基因检测

参考文献

将要发表的文章

附录

附图

致谢