环亚酰胺水解酶的基因克隆、融合表达和生化性质

摘要

环亚酰胺水解酶(cyclicimidehydrolase，CIH，EC.3.5.2.16))是环酰胺酶中的一个亚类，分子量约35kDa小于常见的环酰胺酶(52kDa)，如海因酶或二氢尿嘧啶酶。随着研究的深入，现在已经较明确CIH和海因酶在活性中心，氨基酸序列，底物专一性等方面有着较明显的差异。曾报道菌株Blasterobactersp.A17p-4中CIH参与二元酸的合成，最终进入类似于TCA循环。CIH不但在药物中间体的制备，异生物质的体内降解中发挥作用，而且也可作为一种生产有机酸的新路线和酶法合成手性化合物的新工具。诚然，目前对其研究报道极少。 我们从一株自行分离的假单孢杆菌(PseudomonasputidaYZ-26)中成功地克隆到以琥珀酰亚胺为最适底物的CIH新基因。序列分析表明，其开放读框(ORF)为879bp，相当于编码293个氨基酸，分子量约33.7kDa，基因序列已被GenBank登录(AccessionNo：DQ093858)。网上同源性分析比对，它和来源于Alcaligeneseatrophus112R4的CIH有78％的同源性，而与Blastobactersp.A17p-4CIH的N端20个氨基酸有80％的同源性。 将该酶基因引入载体pET-32M，构建成重组质粒pEI。工程菌株pEI/E.coliBL21(DE3)在LB培养基中用0.25mmol/LIPTG37℃诱导5h，获得较理想的可溶性表达产物，目的蛋白的量约占总菌蛋白的10％，上清中的蛋白约占总表达量的40％，酶活力达5.19U/mL。利用Ni2+-NTAagarose亲和柱和Sephacryl-S-200分子排阻层析获得电泳纯的CIH，其比活为38.5U/mg，活力回收为60.1％，纯化倍数为11.9。对该酶进行生化性质研究，结果表明，其单体Mr约为35kDa，天然Mr为141kDa，最适pH为pH9.0，最适温度为50℃，不同的二价金属离子对酶活性有不同的影响。分别采用比色法和高效液相色谱法(HPLC)测定了CIH催化底物海因，二氢尿嘧啶，DL-5-苯海因、DL-ρ-对羟基苯海因及马来酰亚胺，琥珀酰亚胺的动力学参数，确认该酶对简单的环亚酰胺具有更高的活性及亲合力。参考环酰胺酶的构象数据，利用分子克隆技术将该酶分子中5个His均突变为Ala，即H86A，H90A，H247A，H266A，H270A，结果突变酶均无活性，表明上述His可能对酶构象与活性都是必需的。根据本室对D-海因酶的研究结果，将全长CIH(293个氨基酸残基，即CIH293)C-末端缺失或替代，他们分别为CIH292(-K)、CIH291(-KK)、CIH290(-RKK)、CIH289(-PRKK)、KK292，293EE、KK292，293LL，然后克隆与表达这些突变酶。它们与CIH293相比，表达酶的活性分别为78％，70％，15％，1％，80％和7％。CD和荧光光谱测定表明，其构象变化与活性改变基本一致，表明C-末端电荷基团对酶的构象与活性的重要性。

目录

文摘

英文文摘

1文献综述

2环亚酰胺水解酶基因的克隆与序列分析

3环亚酰胺水解酶表达及纯化

4环亚酰胺水解酶的活性测定

5环亚酰胺水解酶的理化性质

6环亚酰胺水解酶组氨酸及C-端区氨基酸残基重要性评价

参考文献

附录

致谢

承诺书