Aβ（10-21）肽对海马锥形细胞钾电流的影响及LiCl的神经保护功能

摘要

阿尔茨海默病(AD)，又称老年性痴呆，是日趋老龄化的人类社会所面临的一大疑难杂症。由于缺乏行之有效的治疗及预防措施，目前AD已和心脑血管疾病、恶性肿瘤、脑中风并列为导致人类死亡的四大杀手，因而许多发达国家将之视为威胁公共健康和制约经济和社会发展的战略问题之一，相继将攻克该病纳入了国家研究计划。我国也正在步入老龄化社会，老年人口的数量和所占比例不断提高，老年痴呆病人的发病率日趋增高，给社会和患者家庭带来沉重的经济负担，AD的防治已成为十分紧迫的社会问题和医学问题，关系到国家发展和社会进步的长远战略。因此，加快对AD发病机理的研究，提高治疗和预防AD的水平，不仅有望改善老年人的生活质量，提高全民健康水平，延长人类平均寿命，更重要的是将对人类攻克学习和记忆的机制，揭开大脑奥秘，产生重大影响。因此本课题除了具有其本身的学术价值外，还具有潜在的经济效益和社会效益。 第一章主要为文献综述及研究设想，主要从致病机理、诊疗现状等几方面对AD的最新研究进展进行了介绍，重点对β-淀粉样多肽(Aβ)学说的三种假说进行了概括和分析，并据此提出了本论文的立论依据、研究思路、研究对象以及拟采用的研究方法。 第二章介绍了海马细胞离子通道的功能、分类、特征以及膜片钳记录要点，重点介绍了外向钾电流的分离技术、电流．电压特征曲线、动作电位的形成以及钾通道的激活过程、失活过程和复活过程，从中选取出我们实验的最佳参数，这部分是论文第四章、第五章的理论基础和实验条件。 第三章为光谱部分。本章选取与Aβ聚集密切相关的Zn<'2+>、Cu<'2+>为中心离子，采用紫外、荧光、圆二色谱等技术手段，研究了两种金属离子对Aβ(10-21)的变构效应及聚集效应。研究表明：在无金属离子存在下，配制好的Aβ(10-21)呈非聚集态，荧光光谱显示，Zn<'2+>存在可使Aβ(10-21)快速发生聚集，并且呈现一定的浓度依赖性。共振散射光谱也显示有聚集体的生成。圆二色谱则清晰地表明，Zn<'2+>的存在可使Aβ(10-21)的二级构象发生明显变化、α-螺旋百分含量由83.03％变为43.10％，β-折叠和无规则卷曲百分含量由16.97％变为56.90％，使得体系趋于稳定。与Zn<'2+>类似，Cu<'2+>的存在也能使Aβ(10-21)发生聚集，由非聚集态转变为聚集态，同时也使Aβ(10-21)二级构象发生变化，α-螺旋百分含量明显降低，β-折叠和无规则卷曲百分含量明显升高。与Zn<'2+>不同的是，虽然共振散射光谱表明Cu<'2+>的存在也能促进Aβ(10-21)聚集体的生成，但缓冲溶液对上述过程有较大影响。Zn<'2+>、Cu<'2+>是如何使Aβ(10-21)发生聚集的，其准确机理尚需实验进一步确定。 第四章为电生理部分，本章主要采用全细胞膜片钳技术，研究了两种状态(非聚集态和聚集态)的Aβ(10-21)对急性分离的大鼠海马锥形细胞外向钾电流的影响，旨在从通道水平来阐述Ap的致病机理。研究表明：非聚集态的Aβ(10-21)选择性抑制快激活与失活的外向钾电流I<,A>，使I<,A>的激活曲线和失活曲线向负电流方向移动，延长了I<,A>的复活时间常数。与非聚集的Aβ(10-21)相比，被Zn<'2+>、Cu<'2+>聚集后的Aβ(10-21)对外向钾电流I<,A>的抑制作用明显增强，同样浓度抑制率达到了(45.93±0.99)％。聚集后的Aβ(10-21)也使厶的激活曲线和失活曲线向负电位方向移动，但移动幅度要大于非聚集态的Aβ(10-21)，同样，聚集态的Aβ(10-21)使I<,A>的复活时间常数延长的幅度要大于非聚集态的Aβ(10-21)。以上结果说明Aβ(10-21)对I<,A>的抑制作用具有聚集依赖性，Aβ(10-21)在聚集后，其对钾通道各方面的调节作用都明显增强。钾电流在调节细胞膜电势和兴奋性方面起着重要作用，钾通道受抑制，可使细胞膜去极化、细胞的兴奋性增强、加速胞外Ca<'2+>向胞内流动，引起胞内Ca<'2+>超载，由此引发一系列事件，最终造成神经元的损害和死亡，这一过程可能是Aβ神经毒性的分子机理之一。进一步研究表明Aβ(10-21)与钾通道之间的作用方式为静电作用方式。Aβ(10-21)通过静电作用结合于开放的钾通道，加速了通道的失活过程，或者通过静电作用方式结合于关闭的钾通道，延迟了通道的复活过程，从而使钾电流失活变快，复活变慢，电流强度变小。这是Aβ(10-21)抑制钾电流的主要原因。 第五章为锂盐神经保护功能的探讨。锂盐是传统的治躁狂药，最近发现其具有神经保护功能，特别是能够减少AD病人脑中Tau蛋白磷酸化，暗示着锂盐在治疗AD方面具有潜在的应用价值。本章利用膜片钳技术研究了LiCl对海马锥形细胞外向钾电流的作用及其方式，从另一个角度对锂盐的神经保护功能进行了说明，研究表明：LiCl可选择性的增大I<,A>，其半数增大浓度EC<,50>为(22.8±5.45)umol/L，LiCl使I<,A>的激活曲线向负电位移动，使I<,A>的失活曲线向负电位移动，但主要影响激活过程，同时使I<,A>的复活时间变短。激活过程的提前以及复活过程的加速共同导致了I<,A>电流的增大。I<,A>增大，可使细胞膜超极化，消除或着抵消Aβ(10-21)引发的去极化、从而降低细胞的兴奋性损伤。但是从目前研究的情况看，我们还不清楚I<,A>需要增大多少才能够消除Aβ(10-21)引发的去极化，因为通道的调控是个复杂的过程，需要综合考虑多种因素的作用。 第六章为总结和展望，对论文的研究内容进行了概括分析，并对下一步工作进行了展望。 总之，采用光谱技术手段，从实验上证实了两种金属离子Zn<'2+>、Cu<'2+>对Aβ(10-21)的聚集效应和变构效应；采用全细胞膜片钳技术，研究了两种状态(非聚集态和聚集态)的Aβ(10-21)对海马细胞外向钾电流三种过程(激活过程、失活过程和复活过程)的影响，从通道水平阐明了Aβ毒性分子机理以及金属离子在其中所起的的重要作用，提出Aβ(10-21)可作为研究金属离子诱导的Aβ聚集及其与细胞作用的模型片段，在化学、生物、电生理之间搭建了一个相互沟通、交叉研究的平台。另外针对治疗AD策略，论文还对LiCl的神经保护功能进行了研究，从全新的角度对锂盐神经保护的可能机理进行了分析探讨，以上结果对深入了解Aβ的致病机理以及新型靶向药物的开发具有重要意义。

目录

文摘

英文文摘

承诺书

论文创新之处

第一章文献综述及研究设想

1.1研究背景及意义

1.2AD及其研究现状

1.2.1AD百年简史

1.2.2AD病理特征

1.2.3AD病理机制

1.2.4AD诊疗现状

1.3Aβ学说研究进展

1.3.1通道假说

1.3.2氧化应激假说

1.3.3钙假说

1.4本课题研究设想

1.4.1模型细胞的选取

1.4.2多肽片段的选取

1.4.3金属离子的选取

1.4.4研究方法与目标

参考文献

第二章海马细胞膜离子通道及其特征

2.1前言

2.2海马结构及其生理功能

2.3研究离子通道的方法

2.4通道电流的测定

2.4.1钾通道电流的测定

2.4.2钙通道电流的测定

2.4.3钠通道电流的测定

2.5离子通道的一些基本特征

2.5.1膜电流与膜电位

2.5.2静息电位与动作电位

2.5.3通道的离子选择性

参考文献

第三章 金属离子(Zn2+、Cu2+)诱导的Aβ(10-21)聚集

3.1前言

3.2研究金属离子诱导Aβ多肽聚集的常用方法

3.2.1聚集度测定法(Aggregation Assay,AA)或沉淀测定法(Sedimentation Assay,SA)

3.2.2圆二色谱(Circular Dichroism,CD)

3.2.3拉曼光谱(Raman Spectroscope)

3.2.4瑞利散射(Rayleigh Scattering,RS)和共振瑞利散射(Resonance Rayleigh Scattering,RRS)

3.2.5刚果红(Congon Red,CR)染色实验和硫代黄素(Thioflavine T,ThT)荧光检测

3.2.6固态核磁共振(Solid-state NMR)

3.2.7傅立叶红外(Fourier Trasform Infrared,FTIR)

3.3Zn2+诱导的Aβ(10-21)聚集

3.3.1实验仪器

3.3.2实验试剂

3.3.3紫外吸收测Aβ(10-21)的浓度

3.3.4荧光胺法测聚集度

3.3.5共振散射光谱

3.3.6圆二色谱测构象变化

3.3.7聚集机理的分子模拟

3.4Cu2+诱导的Aβ(10-21)聚集

3.4.1实验仪器及试剂

3.4.2聚集度的测定

3.4.3共振散射光谱

3.4.4圆二色谱测构象变化

3.4.5聚集机理的分子模拟

3.5结论与讨论

参考文献

第四章 非聚集态、聚集态Aβ(10-21)对大鼠海马锥形细胞外向钾电流的影响

4.1前言

4.2Zn2+诱导的Aβ(10-21)聚集前后对外向钾电流的影响

4.2.1实验部分

4.2.2实验结果

4.2.3结论与讨论

4.3 Cu2+诱导的Aβ(10-21)聚集前后对外向钾电流的影响

4.3.1实验部分

4.3.2实验结果

4.3.3结论与讨论

参考文献

第五章 氯化锂对大鼠海马锥形细胞外向钾电流的影响

5.1锂盐

5.1.1生物体内的锂

5.1.2锂的生理和生化作用

5.1.3锂与健康及疾病的关系

5.1.4锂的作用机制

5.1.5锂盐的神经保护功能

5.2实验部分

5.2.1实验仪器

5.2.2实验溶液的配制(mmol/L)

5.2.3神经元的急性分离

5.2.4全细胞膜片钳记录

5.2.5数据处理

5.3实验结果

5.3.1 IA和IK的分离

5.3.2 LiCl对IA和IK的影响

5.3.3 LiCl对IA和IK激活动力学的影响

5.3.4 LiCl对IA失活动力学的影响

5.3.5 LiCl对IA复活动力学的影响

5.4结论与讨论

参考文献

第六章 总结与展望

6.1总结

6.1.1 Zn2+、Cu2+诱导的Aβ(10-21)聚集及Aβ-Zn(Ⅱ)、Aβ-Cu(Ⅱ)复合物的形成

6.1.2 Aβ-Zn(Ⅱ)、Aβ-Cu(Ⅱ)复合物对离子通道的调节作用

6.1.3 LiCl的神经保护功能

6.1.4预防及治疗AD的策略

6.2思考与展望

附录Ⅰ论文缩略词

附录Ⅱ攻读博士期间发表的论文

附录Ⅲ代表性论文

致谢