利用人工microRNAs对拟南芥DUF647家族基因的特异沉默

摘要

DUF647(Domain of unknown function)基因家族是拟南芥基因组中一个功能未知的基因家族，由基因AT1G13770、AT2G23470、AT2G31190、AT3G45890、AT5G01510和AT5G49820组成。通过EMS诱变筛选已获得了基因AT2G31190和AT3G45890的突变体。但迄今为止还没有基因AT1G13770、AT2G23470、AT5G01510和AT5G49820的突变体，因此对其功能的研究受到了很大的限制。人工微小RNAs(artificial microRNAs，amiRNAs)基因沉默技术是一种研究基因功能的有效手段。本论文工作利用amiRNAs对拟南芥DUF647家族成员AT1G13770、AT2G23470、AT5G01510和AT5G49820进行基因沉默研究，试图得到这4个基因敲除的突变体，从而研究这些基因的功能，这对于系统了解DUF647家族基因在拟南芥生命活动中的作用具有重要的意义。
　　本论文工作利用WMD平台设计了靶向基因AT1G13770、AT2G23470、AT5G01510、AT5G49820的amiRNAs;通过重叠PCR，以质粒pRS300为模板合成了含有我们所设计的amiRNAs序列的amiRNAs前体;构建了融合amiRNAs前体的植物表达载体pCHF3-amiRNAs;通过农杆菌AGL1介导用蘸花法将amiRNAs前体转入拟南芥中;通过卡那霉素抗性筛选和PCR检测获得了基因组内整合有amiRNAs的转基因拟南芥植株;利用RT-PCR检测到了靶基因表达下调的转基因株系;这些转基因株系都表现出了较明显的突变表型，尤其是AT1G13770-amiRNA和AT5G49820-amiRNA转基因株系，营养器官和生殖器官均出现了不同程度的发育缺陷。这些结果表明基因AT1G13770、AT2G23470、AT5G01510、AT5G49820在拟南芥发育过程中具有非常重要的作用。

目录

摘要

第一部分 文献综述

1．1 植物小RNAs概述

1．2 植物miRNAs的研究进展

1．2．1 植物miRNAs的主要特点

1．2．2 植物miRNAs的生物合成

1．2．3 植物miRNAs的作用机制

1．2．4 植物miRNAs的功能

1．2．5 植物miRNAs靶基因的鉴定

1．3 植物基因沉默技术的研究进展

1．3．1 siRNAs介导的基因沉默技术

1．3．2 amiRNAs基因沉默技术

1．4 本研究工作的背景和意义

第二部分 利用人工microRNAs对拟南芥DUF647家族基因的特异沉默

2．1 材料与方法

2．1．1 植物材料与生长条件

2．1．2 方法

2．2 结果与讨论

2．2．1 amiRNAs前体的产生

2．2．2 amiRNAs表达载体的构建

2．2．3 转基因拟南芥植株的抗性筛选

2．2．4 转基因拟南芥植株的PCR检测

2．2．5 转基因拟南芥植株中靶基因的转录分析

2．2．6 转基因植株的表型观测

总结

参考文献

个人简历

在读硕士期间发表论文

致谢

声明