苦荞SRAP和SSR分子标记遗传连锁图谱的构建

摘要

苦荞是一种二倍体一年生作物，广泛种植于亚洲、欧洲。苦荞可在高海拔地区种植，生长期短，种子蛋白含量高，在我国部分山区及北半球一些国家是重要的粮食作物。苦荞的氨基酸含量均衡，含有芦丁、槲皮素、山奈醇-3-芸香糖苷等黄酮类药用成分。苦荞大多种植于贫瘠的土地上，产量不高，通过分子标记辅助育种方法提高其抗逆性，改良品质及产量是苦荞产业化发展的重要课题。
　　遗传图谱的构建是分子标记辅助育种的基础，同时也是植物基因组研究的重要内容之一。对于具有重要经济价值的苦荞来说，构建遗传图谱可用于优良基因和重要农艺性状定位、分子标记辅助育种，意义重大。
　　本研究以滇宁一号（母本）与野苦荞（父本）的136株F2代为作图群体，利用两种分子标记，对适用于苦荞的SRAP和SSR反应体系的建立以及标记的分离分析等方面进行了研究，并构建出目前第一张苦荞分子遗传连锁图谱。具体研究内容如下:
　　采用交互正交设计L27(313)对苦荞SRAP-PCR、SSR-PCR反应体系进行了5因素（Mg2+、dNTP、Taq酶、模板DNA和引物）3水平优化实验，并进行了验证，最佳SRAP-PCR反应体系为:总体积20μl，Mg2+1.5mmol/L，dNTP0.2mmol/L，Taq酶1.5U，模板DNA40ng，引物0.25μmol/L，10×buffer2μl;最佳SSR-PCR反应体系为:总体积20μl，Mg2+1mmol/L，dNTP0.3mmol/L，Taq酶1.5U，模板DNA30ng，引物0.25μmol/L,10×buffer2μl。
　　将扩增产物进行非变性与变性PAGE和两种电泳操作系统检测，结果表明，非变性PAGE、DYCZ-24F操作系统更适合于SRAP的分析。
　　利用165对SRAP引物扩增亲本及杂交F1代DNA，筛选到多态性引物43对，多态性比例为26.1％。用43对多态性引物对F2群体进行分析，共获得多态性标记50个，其中引物M1E2、M3E3、M6E19、M10E4、M11E17分别产生两条多态性标记;引物M1E6产生3条多态性标记。经卡方测验，获得的50个多态性标记中，有35个(70％)SRAP标记符合孟德尔分离比例。从148对SSR引物中筛选到多态性引物26对，多态性比例为17.6％。用26对多态性引物对F2群体进行分析，只有一对引物标记无偏分离现象，其它25对全部偏于母本。
　　利用Mapmaker/EXP3.0软件构建了包含10个连锁群，由37个SRAP标记、1个SSR标记组成的遗传连锁图谱。该图谱总长725.1cM，标记间最大图距为46.6cM，最小图距为2.2cM，平均图距为25.9cM;连锁群上的标记数在2-6个之间，LG4、LG6包含的标记最多，均为6个;LG3、LG8、LG9包含的标记数最少，为两个。
　　本论文构建的苦荞遗传连锁图谱，优点是标记在图谱上清晰、特异扩增、重复性好;缺点是标记少、密度低，需要进一步利用SRAP标记进行加密，建立较完整的苦荞分子遗传连锁图谱。

目录

摘要

第一章 文献综述

1．1 苦荞概况

1．1．1 苦荞特性及资源分布

1．1．2 苦荞功能及营养价值

1．2 遗传图谱构建的理论基础及方法

1．2．1 遗传图谱构建的理论基础

1．2．2 遗传图谱构建的基本方法

1．3 作图群体

1．3．1 亲本的选配

1．3．2 分离群体类型的选择

1．3．3 群体大小的确定

1．4 用于图谱构建的遗传标记

1．4．1 形态学标记

1．4．2 细胞学标记

1．4．3 生化标记

1．4．4 分子标记

1．5 图谱制作的统计学原理与数据分析方法

1．5．1 两点测验

1．5．2 多点测验

1．5．3 分子标记分离数据的数学处理

1．6 偏分离现象

1．7 遗传作图软件

1．8 苦荞遗传连锁图谱研究状况

1．9 研究目的与意义

第二章 试验材料与方法

2．1 试验材料、试剂和仪器

2．1．1 材料

2．1．2 试剂

2．1．3 仪器

2．2 研究方法

2．2．1 苦荞DNA的提取

2．2．2 SRAP-PCR反应体系优化

2．2．3 SSR-PCR反应体系优化

2．2．4 作图群体SRAP、SSR分析

2．2．5 分离数据记录与标记命名规则

2．2．6 遗传图谱构建

第三章 结果与分析

3．1 以苦荞干叶片为材料提取DNA的方法

3．2 苦荞SRAP-PCR及检测技术的建立

3．2．1 SRAP-PCR正交试验分析

3．2．2 优化体系重复性验证

3．2．3 非变性与变性PAGE结果比较

3．2．4 两种型号电泳槽电泳结果比较

3．3 SRAP引物筛选结果

3．4 SRAP标记的分离检测

3．5 苦荞SSR-PCR及检测技术的建立

3．5．1 SSR-PCR正交试验分析

3．5．2 优化体系重复性验证

3．6 SSR引物筛选结果

3．7 SSR标记的分离检测

3．8 苦荞遗传连锁图谱构建

第四章 讨论

4．1 苦荞遗传连锁图谱构建中亲本的选择

4．2 SRAP分析中优化PCR反应体系的必要性

4．3 SSR分析中优化PCR反应体系的必要性

4．4 分子标记的偏分离现象

4．5 苦荞中的SSR标记

4．6 苦荞遗传图谱覆盖率及分子标记的密度

参考文献

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

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