新型邻菲罗啉衍生物与四链体DNAs的相互作用及体外生物活性研究

摘要

四链体DNA特殊结构的发现结合现代分子生物学技术对其生物学功能与肿瘤关系的揭示，为高效、低毒抗肿瘤药物的开发提供了新契机。本课题利用生物物理学和生物化学法系统地研究了新颖二取代邻菲罗啉衍生物(3a-5a、3b-5b)与人端粒h-telo、i-motif以及原癌基因启动子(c-myc、c-kit2)四链体DNAs间的键合作用，并检测了化合物对端粒酶活性、癌细胞增殖以及细胞周期进程的影响。
　　 1.FRET-melting、UV-melting与PCRStop实验结果表明，六个化合物是潜在的四链体结构稳定剂;竞争FRET-melting实验指出化合物可在不同程度上选择性识别G-四链体DNAs，特别地，乙酰基侧链延长系列3b-5b表现出对G-四链体相对于双螺旋DNA更强的识别能力。TRAP分析得出，化合物在微摩尔级浓度显著地抑制了端粒酶活性。
　　 2.FID、紫外可见吸收滴定、等摩尔连续变化及荧光滴定实验结果显示，所有化合物是好的四链体DNAs键合剂，与四链体DNAs的相互作用模式可能为π-π堆积。化合物与G-四链体DNAs、i-motif以及ct-DNA的结合常数范围分别为0.55～7.24×105M-1、1.22～8.12×104M-1和1.05～2.51×105M-1;对于相同系列的化合物，与G-四链体DNA的结合常数大于与ct-DNA以及与i-motif的结合常数。与h-telo、i-motif四链体的键合计量比分别为2∶1和1∶1。
　　 3.CD实验表明，化合物可诱导人端粒四链体形成反平行G-四链体构象;c-myc、c-kit2以及i-motif四链体的CD谱特征峰形状没有明显变化，化合物仅对其二级结构、构象产生微扰。
　　 4.MTT比色法研究显示，3b-5b均能抑制MCF7和HepG2细胞增殖，其中3b效果最显著，相应的IC50值分别为1.48和6.86μM。细胞周期测试表明，化合物3b-5b都能不同程度阻止MCF7和HepG2细胞周期进程，对于MCF7细胞，3b诱导细胞周期停滞在G2/M期，4b和5b诱导细胞周期停滞在G0/G1和G2/M期;对于HepG2细胞，3b、4b和5b将细胞周期阻滞在G2/M期。然而，对于含一个亚甲基侧链系列化合物3a-5a来说，没有观察到明显的癌细胞增殖抑制活性。

目录

摘要

第一章 综述

1．1 引言

1．2 四链体DNAs的结构与生物学功能

1．2．1 G-四链体DNAs的结构与生物学功能

1．2．2 I-motif四链体DNA的结构与生物学功能

1．3 识别四链体DNAs靶分子的研究进展

1．3．1 小分子配体与四链体DNAs的作用模式

1．3．2 以四链体DNAs为靶点的小分子配体

1．4 本论文的设计思路和研究内容

1．4．1 设计思路

1．4．2 研究内容

第二章 二取代邻菲罗啉衍生物的合成及结构表征

2．1 引言

2．2 实验材料及仪器

2．2．1 实验材料

2．2．2 实验仪器

2．3 二取代邻菲罗啉衍生物的合成路线

2．4 二取代邻菲罗啉衍生物的合成及结构表征

2．4．1 N，N’-双(2-氨基-6-吡啶基)-2，9-二甲酰胺-1，10-邻菲罗啉

2．4．2 N，N’-双(2-(3-氯丙酰胺基)-6-吡啶基)-2．9-二甲酰胺-1，10-邻菲罗啉

2．4．3 1，10-邻菲罗啉-2，9-二甲酰-6-(3-哌啶-1-基-丙酰胺基)-吡啶-2-胺

2．4．4 1，10-邻菲罗啉-2，9-二甲酰-6-(3-吡咯-1-基-丙酰胺基)-吡啶-2-胺

2．4．5 1，10-邻菲罗啉-2，9-二甲酰-6-(3-哌嗪-1-基-丙酰胺基)-吡啶-2-胺

2．5 实验小结

第三章 二取代邻菲罗啉衍生物与四链体DNAs相互作用研究

3．1 引言

3．2 小分子配体与四链体DNAs相互作用的研究方法

3．2．1 紫外可见吸收光谱

3．2．2 荧光共振能量转移熔点技术(FRET-melting)

3．2．3 聚合酶链式反应停止分析(PCR Stop)

3．2．4 荧光光谱

3．2．5 荧光嵌入剂置换分析(FID)

3．2．6 圆二色谱

3．2．7 等摩尔连续变化分析

3．2 实验材料及仪器

3．2．1 实验材料

3．2．2 实验仪器

3．3 实验内容

3．3．1 DNA预处理

3．3．2 FRET-melting实验

3．3．3 UV-melting实验

3．3．4 PCR Stop实验

3．3．5 FID分析实验

3．3．6 紫外可见吸收滴定实验

3．3．7 荧光滴定实验

3．3．8 等摩尔连续变化分析实验

3．3．9 圆二色谱实验

3．4 实验结果与讨论

3．4．1 FRET-melting实验

3．4．2 UV-melting实验

3．4．3 PCR Stop实验

3．4．4 FID分析实验

3．4．5 紫外可见吸收滴定实验

3．4．6 荧光滴定实验

3．4．7 等摩尔连续变化分析

3．4．8 圆二色谱实验

3．6 小结

第四章 二取代邻菲罗啉衍生物对端粒酶活性的影响

4．1 引言

4．1．1 端粒酶活性检测法

4．2 实验材料及仪器

4．2．1 实验材料

4．2．2 实验仪器

4．3 端粒酶重复扩增分析

4．3．1 HeLa细胞培养

4．3．2 细胞裂解及端粒酶提取

4．3．3 蛋白提取液浓度的测定

4．3．4 端粒酶活性的检测

4．4 实验结果与讨论

4．5 小结

第五章 二取代邻菲罗啉衍生物对癌细胞增殖的影响

5．1 引言

5．1．1 细胞活性检测法

5．1．2 细胞周期分析法

5．2 实验材料及仪器

5．2．1 实验材料

5．2．2 实验仪器

5．3 实验内容

5．3．1 细胞培养

5．3．2 细胞活力测试

5．3．3 细胞周期测定

5．4 实验结果与讨论

5．4．1 二取代邻菲罗啉衍生物对MCF7细胞和HepG2细胞活力的影响

5．4．2 二取代邻菲罗啉衍生物对MCF7细胞和HepG2细胞周期的影响

5．5 小结

第六章 总结与展望

6．1 总结

6．2 展望

参考文献

附录

攻读硕士学位期间发表的论文

致谢

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