苦荞黄酮类化合物的稳定性及其与胰蛋白酶相互作用的研究

摘要

苦荞，由于富含黄酮类化合物，被誉为药食同源作物。苦荞黄酮主要包括芦丁，芦丁经水解变成异槲皮素和槲皮素。黄酮具有降血糖、降血脂、防癌、增强免疫力、杀菌、抗氧化，清除自由基等功效。胰蛋白酶是一种触发酶，过多的胰蛋白酶，能激活其他的消化酶原，由于胰蛋白酶在消化过程与新陈代谢过程中的重要性，很多疾病的发生都与胰蛋白酶有关。因此我们研究了苦荞黄酮的稳定性及其与胰蛋白酶的相互作用。
　　 首先，运用紫外、可见光光谱法研究了储存时间、光照、加热、pH值、食品添加剂、氧化剂、还原剂和金属离子等条件对2种方法提取的苦荞黄酮类化合物（1#提取物，2#提取物）的稳定性的影响。结果表明，储存时间、光照、加热、酸性、食品添加剂、氧化剂、金属离子K+、Na+、Ca2+、Mg2+存在的条件下苦荞黄酮提取物有较好的稳定性;碱性、还原剂、金属离子Cu2+、Fe2+、Al3+、Fe3+条件下，苦荞黄酮提取物的稳定性易受到影响;在试验的各种条件下，1#提取物的稳定性略高于2#提取物。并且研究了苦荞黄酮（1#提取物、2#提取物）、荞麦糖醇（3#提取物）对胰蛋白酶活性的影响。结果表明，1#提取物、2#提取物对胰蛋白酶有明显的抑制作用，2#提取物对胰蛋白酶的抑制活性明显高于1#提取物;3#提取物则在较高浓度下对胰蛋白酶表现出抑制活性。三种提取物的半数抑制浓度分别为:0.634 g·L-1、0.166 g·L-1、7.866 g·L-1。
　　 其次，运用荧光光谱法研究分析了槲皮素(Que)、异槲皮素(Iso)、芦丁(Rut)三种黄酮与胰蛋白酶的相互作用，结果表明:三种黄酮对胰蛋白酶的荧光发射光谱均有静态猝灭作用，并伴有最大发射峰的红移现象，这说明了三种黄酮和胰蛋白酶的结合使胰蛋白酶的色氨酸残基所处的微环境发生了变化;计算了三种黄酮与胰蛋白酶发生反应的结合常数、结合位点数;根据热力学相关原理计算得出三种黄酮与胰蛋白酶的相互作用是一个熵值增加、释放能量的自发反应，其主要作用力为疏水作用与氢键作用;在相同的摩尔浓度下三种黄酮的吸收光谱与胰蛋白酶的发射光谱相互重叠，表明三种黄酮对胰蛋白酶的荧光猝灭可能是由非辐射能量转移引起的。
　　 最后，运用紫外光谱法，并结合酶促动力学的相关原理，研究了Que、Rut、Iso三种结构相似的黄酮类化合物对胰蛋白酶活性的影响，以期能够更好的说明三种黄酮与胰蛋白酶的相互作用。结果显示，在本实验所设浓度下，Que对胰蛋白酶有较强的抑制作用，Iso、Rut对胰蛋白酶活性无明显的抑制作用。经过计算，Que对胰蛋白酶的半数抑制浓度(IC50)为0.115mol·L-1。根据米氏方程相关理论，计算得到胰蛋白酶的Km为3.97×10-4 mol·L-1，Que对胰蛋白酶的抑制类型为非竞争性抑制与反竞争抑制混合类型，抑制常数Ki为14.439×10-8，由此看出，Que与胰蛋白酶有较强的亲和力，相对于Iso、Rut更易于与胰蛋白酶结合。

目录

摘要

第一章 文献综述

1．1 苦荞及其营养保键作用

1．2 苦荞中的黄酮类化合物

1．2．1 苦荞黄酮的种类与结构

1．2．2 苦荞黄酮的生物学活性与药理功能

1．2．3 苦荞黄酮的研究进展

1．3 苦荞中的肌醇类物质

1．3．1 肌醇类物质的生理活性功能

1．3．2 肌醇类物质的研究进展

1．3．3 荞麦糖醇

1．4 胰蛋白酶与胰蛋白酶抑制剂

1．4．1 胰蛋白酶

1．4．2 与胰蛋白酶相关的疾病

1．4．3 胰蛋白酶抑制剂

1．5 生物活性小分子与生物大分子相互作用

1．5．1 研究概述

1．5．2 多酚类化合物与蛋白质的研究概况

1．6 本文研究的内容及意义

第二章 苦荞黄酮类化合物的稳定性研究

2．1 材料与方法

2．1．1 材料

2．1．2 试剂和仪器

2．1．3 苦荞黄酮待测液的浓度选择及光谱特性分析

2．1．4 不同因素对苦荞黄酮化合物的影响

2．1．5 数据统计分析

2．2 结果与分析

2．2．1 苦荞黄酮待测液的浓度确定及光谱特性

2．2．2 储存时间和光照对苦荞黄酮稳定性的影响

2．2．3 温度对苦荞黄酮稳定性的影响

2．2．4 pH对苦荞黄酮稳定性的影响

2．2．5 食品添加剂对苦荞黄酮稳定性的影响

2．2．6 氧化剂对苦荞黄酮稳定性的影响

2．2．7 还原剂对苦荞黄酮稳定性的影响

2．2．8 金属离子对苦荞黄酮稳定性的影响

2．3 讨论

第三章 苦荞麸皮提取物对胰蛋白酶活性的影响

3．1 材料与方法

3．1．1 材料

3．1．2 方法

3．2 结果与分析

3．2．1 反应时间的判断

3．2．2 底物浓度的确定

3．2．3 苦荞提取物对胰蛋白酶的作用

3．3 讨论

第四章 苦荞中三种主要黄酮(Que、Rut、Iso)与胰蛋白酶相互作用的研究

4．1 材料与方法

4．1．1 材料

4．1．2 实验方法

4．2 结果与分析

4．2．1 盐离子浓度对胰蛋白酶荧光光谱的影响

4．2．2 Que、Iso、Rut三种黄酮对胰蛋白酶的荧光猝灭作用

4．2．3 Que、Iso、Rut对胰蛋白酶的荧光猝灭机理

4．3．4 Que、Iso、Rut与胰蛋白酶结合常数和结合位点的计算分析

4．2．5 Que、Iso、Rut与胰蛋白酶作用的热力学研究

4．2．6 非辐射能量转移分析

4．3 小结

第五章 苦荞三种黄酮对胰蛋白酶活性的影响

5．1 材料与方法

5．1．1 材料

5．1．2 实验方法

5．2 结果与分析

5．2．1 不同浓度的Rut、Iso、Que对胰蛋白酶活性的影响

5．2．2 胰蛋白酶的米氏常数Km的测定

5．2．3 槲皮素对胰蛋白酶抑制类型的判断及其抑制常数的计算

5．3 小结与讨论

第六章 总结与展望

6．1 本课题主要结论

6．2 展望

参考文献

缩略语

附录

致谢

承诺书

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