河南华溪蟹生殖调控基因vasa的克隆和原核表达

摘要

vasa基因编码一种ATP依赖的RNA解旋酶，属于DEAD-box家族，最先在果蝇（Drosophila）中被发现。vasa基因在生殖细胞中特异表达，在动物生殖细胞发生和生殖调控中发挥着重要作用，被用作生殖细胞的分子标记物，主要用于配子发生和原生殖细胞（PGCs）的起源、迁移和分化等方面的研究。
　　本文通过RACE技术克隆得到了河南华溪蟹（Sinopotamon henanense）vasa基因cDNA序列，证实了vasa基因仅在生殖细胞中特异表达；构建了河南华溪蟹VASA蛋白原核表达载体Vexp-28a、Vexp-32a、Ve-28a及Ve-32a，并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行了原核表达。
　　本文克隆得到的河南华溪蟹 vasa基因 cDNA序列长2896bp，其中编码区长1329bp，编码442个氨基酸的蛋白。Blast比对结果表明由该 cDNA序列推测翻译的蛋白氨基酸序列与鱼类、两栖类、鸟类、哺乳类以及一些无脊椎动物的 VASA蛋白氨基酸序列有较高的相似性；结构域分析也表明该氨基酸序列具有 DEAD-box家族共有的4个保守motif（motif I、motif Ia、motif Ib、motif II）、一个锌指结构和GG重复序列，还具有 VASA亚家族基因专一性特征结构，如 Q-motif、RGG重复序列和甘氨酸富集区，与DEAD-box家族蛋白具有的8个保守结构域motif I、motif Ia、motif Ib、motif II、motif III、motif IV、motif V、motif VI以及两个锌指结构、一个Q-motif、GG重复的结构相比，本文获得的蛋白氨基酸序列在motif II之前（包括motif II）的序列是正确的，但在motif II之后的序列中，由于一些原因使蛋白翻译提前终止，因此，我们所得到的Sh-vasa基因cDNA序列的3’端还待进一步验证；多序列比对和系统进化分析显示该cDNA序列编码的氨基酸序列与其它虾蟹类的VASA蛋白进化关系最近。以上结果均表明，本文所获得的cDNA序列确定为河南华溪蟹vasa基因5’端及部分编码区cDNA序列。通过半定量PCR（Sq-PCR）监测河南华溪蟹vasa基因在不同组织中的表达情况，结果显示，vasa基因在河南华溪蟹体内仅在生殖细胞中特异表达。
　　以得到的河南华溪蟹vasa基因cDNA序列为基础，设计两对引物，通过PCR，在选定的vasa基因片段两端加上EcoR I和Xho I酶切位点，然后利用基因重組技术将获得的vasa基因表达片段分别克隆至pET-28a、pET-32a原核表达载体，经酶切鉴定和测序，成功构建河南华溪蟹VASA蛋白原核表达载体Vexp-28a、Vexp-32a、Ve-28a及Ve-32a，并通过IPTG诱导进行原核表达，蛋白上清和包涵体沉淀分别经过His?Tag 亲和层析柱分离、纯化，通过SDS-PAGE分析以及Western blot鉴定，所得蛋白并非河南华溪蟹VASA融合蛋白，需在河南华溪蟹vasa基因cDNA序列内重新选取表达片段，或重新选择表达载体，改进实验方案，再次实验，以期获得河南华溪蟹VASA融合蛋白。