炎症和高渗因素对角膜上皮干细胞活性的影响及其机制的体外研究

摘要

目的:通过体外使用炎性分子和高渗透压处理小鼠角膜上皮干/祖细胞系(TKE2)和原代兔角膜缘干细胞，分别模拟持续性炎症和干眼高渗因素，研究其对角膜上皮干细胞活性的不同影响及其可能的机制。
　　方法:1.体外角膜上皮干细胞模型的建立:(1)小鼠角膜上皮干/祖细胞系(TKE2):采用含BPE和EGF的KSFM培养基培养;(2)原代兔角膜缘干细胞:新西兰大白兔6只，耳缘静脉空气栓塞处死后剪取其眼球，无菌条件下Dispase-Trypsin/EDTA消化法分离获得原代兔角膜缘干细胞，将细胞以1000个/孔的密度接种于6孔板中，采用含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基培养。
　　2.炎性分子对角膜上皮干细胞活性的影响:用10 ng/ml IFN-γ，IL-1β或TNF-α处理角膜上皮干细胞8天，筛选对细胞克隆形成能力影响较大的炎性分子。采用筛选出的IL-1β进行进一步研究，用不同浓度的IL-1β(0，1，5，10，20 ng/ml)处理角膜上皮干细胞8天，检测其对细胞克隆形成能力及细胞生存能力的影响。
　　3.高渗因素对角膜上皮干细胞活性的影响:通过不同浓度的NaCl(0，10，30，60，90 mM)处理角膜上皮干细胞8天，检测其对细胞克隆形成能力及细胞生存能力的影响。
　　4.炎性分子和高渗因素共同作用对角膜上皮干细胞克隆形成能力的影响:用10ng/ml IL-1β复合不同浓度的NaCl处理角膜上皮干细胞8天，检测两种不同因素的叠加对细胞克隆形成能力的影响。
　　5.炎性分子和高渗因素对角膜上皮干细胞活性影响的可能机制研究:通过研究IL-1β或NaCl处理对角膜上皮干细胞细胞凋亡和坏死、细胞周期分布、干细胞标志物表达及活性氧(ROS)水平等方面的影响来探讨炎性分子和高渗因素对角膜上皮干细胞活性影响的可能机制。
　　结果:1.三种不同炎性分子处理TKE2细胞，发现与对照或IFN-γ处理相比，IL-β和TNF-α处理能显著影响TKE2细胞的克隆形成能力和克隆集落大小。用不同浓度IL-1β或NaCl处理TKE2细胞发现，随IL-1β和NaCl浓度的增加，TKE2细胞克隆形成率和集落直径的减小呈现明显的剂量依赖效应;且IL-1β或NaCl同样能够显著影响兔原代角膜缘干细胞的克隆形成能力。而当IL-1β与不同浓度的NaCl共同处理TKE2细胞时，其克隆形成效率和集落直径比单独用IL-1β处理时减小的更为显著。不同浓度IL-1β或NaCl处理TKE2细胞能够不同程度的影响细胞的存活，其中高浓度的NaCl对细胞的存活影响更大。
　　2.高浓度的NaCl(＞60 mM)会造成显著的细胞凋亡和坏死，使细胞周期停滞在G2/M期;而IL-1β几乎不造成细胞凋亡和细胞周期分布的改变。IL-1β和NaCl可下调TKE2细胞干细胞标记物△Np63的表达，且NaCl可明显上调分化上皮细胞标记物involucrin的表达。IL-1β和NaCl处理均可升高TKE2细胞内ROS的水平。
　　结论:1.炎性分子IL-1β可抑制角膜上皮干细胞的克隆形成能力。
　　2.NaCl模拟的高渗透压微环境下，干细胞表现为早期凋亡甚至坏死，细胞周期阻滞。
　　3.炎性分子和高渗因素对角膜上皮干细胞活性的影响可能与其过度活化细胞内ROS的水平相关。

目录

声明

摘要

主要缩略词表

引言

第一章 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 实验仪器与耗材

1．2．1 实验仪器

1．2．2 实验耗材

1．2．3 实验试剂

1．2．4 主要溶液配制

1．3 实验方法

1．3．1 TKE2细胞的培养和传代

1．3．2 原代兔角膜缘干细胞的分离与培养

1．3．3 细胞的冻存

1．3．4 细胞的复苏

1．4 细胞形态学观察

1．5 炎性分子和高渗因素对角膜上皮干细胞活性的影响

1．5．1 炎性分子和高渗因素对角膜上皮干细胞克隆形成能力的影响

1．5．2 炎性分子和高渗因素对TKE2细胞生存能力的影响

1．6 炎性分子和高渗因素对角膜上皮干细胞活性影响的可能机制研究

1．6．1 炎性分子和高渗因素对TKE2细胞凋亡与坏死能力的影响

1．6．2 炎性分子和高渗因素对TKE2细胞周期分布的影响

1．6．3 炎性分子和高渗因素对干细胞标志物involucrin与ΔNp63表达的影响

1．6．4 炎性分子和高渗因素对细胞内活性氧(ROS)水平的影响

第二章 结果

2．1 炎症和高渗因素对TKE2细胞克隆形成能力的影响

2．2 炎症和高渗因素对原代兔角膜缘干细胞克隆形成能力的影响

2．3 炎性分子和高渗因素对TKE2细胞生存率的影响

2．4 炎性分子和高渗因素对TKE2凋亡与坏死能力的影响

2．5 炎性分子和高渗因素对TKE2细胞周期分布的影响

2．6 炎性分子和高渗因素对TKE2细胞involucrin或ΔNp63表达的影响

2．7 IL-1β和NaCl对TKE2细胞活性氧(ROS)水平的影响

第三章 讨论

第四章 结论

参考文献

综述 角膜缘干细胞的研究现状及展望

攻读学位期间取得的研究成果

致谢