海燕皂苷及其它活性物质的制备及其生物功能研究

摘要

海燕(Asterinapectinifera)为我国黄渤海海域常见底栖棘皮动物，处于海洋底栖动物食物链的顶端，主要分布于烟威渔场近岸水域、渤海中部及长山岛附近海域，在分类上属棘皮动物门，海星纲，有棘目，海燕科，在传统中医中可入药，李时珍在《本草纲目》中将之列入介部，有较为详细的描述。传统中医理论认为，海燕可平肝和胃，制酸止痛，在我国民间，曾广泛用于治疗胃溃疡、甲状腺肿大、腹泻、中耳炎、癫痫等疾病；海燕作为我国黄渤海海域棘皮动物的优势种之一，在山东沿海特别是胶东半岛有大量分布，资源丰富、成本低廉，是一种具有巨大开发利用价值的海洋生物资源。因海燕喜食扇贝、牡蛎、贻贝、鲍鱼等软体动物，对正常的海水养殖和生产是一种威胁，且误食可对人体产生毒害，故往往被认为是一种有害或无用动物。迄今为止，海燕这种潜在海洋生物资源一直未能得到充分的开发利用，为充分开发海燕的药用和食用价值，本文以海燕皂苷的分离纯化及活性筛选研究为重点，对海燕皂苷、多不饱和脂肪酸、酸性粘多糖及海燕生殖腺的营养成分等进行了较为全面系统的研究，以期为海燕皂苷及其它天然活性物质开发利用提供理论依据与技术支持。 研究结果表明：从黄海产海燕中提取的总皂苷呈淡黄色，微有粘性，振荡其水溶液可产生持久的泡沫反应，微量的皂苷即使家兔血液产生溶血反应，该产品溶于水、甲醇、含水乙醇及正丁醇，不溶于苯、醚、丙酮等有机溶剂，熔点为242～255℃。 海燕供试组织中皂苷的分布不同，其中胃中海燕皂苷分布较多，幽门盲囊、体壁及生殖腺中依次递减。因此就提取海燕皂苷而言，海燕供试组织中胃有较大的利用价值，可作为生理活性物质海燕皂苷的主要来源；从总溶血指数(H.I.)来看，各组织中海燕皂苷的溶血活性大小依次为幽门盲囊、胃、体壁和生殖腺，海燕各不同组织中所含海燕皂苷活性不同亦是在实践中利用具体组织时所要考虑的重要因素之一。 综合利用大孔树脂吸附层析、硅胶柱层析、葡聚糖凝胶柱层析等分离纯化手段，可以有效分离纯化海燕皂苷；分离纯化的化合物为白色无定形粉末，HPLC检测含量≥60％，UV，IR及NMR测定结果表明该组分为海燕甾体皂苷。海燕皂苷单体化合物分离纯化及结构有待于进一步研究。 通过对动物呼吸系统的实验研究表明：海燕皂苷能显著增加小鼠气管内苯酚红分泌量；延长致咳潜伏期，减少2min内咳嗽次数；延长引喘潜伏期；有显著的祛痰、镇咳和平喘作用。 采用醋酸致小鼠腹腔毛细胞血管通透性升高的急性炎症模型、二甲苯所致小鼠耳肿胀模型、新鲜鸡蛋清所致大鼠足跖肿胀的的亚急性炎症模型以及小鼠流感性肺炎等一系列模型的抗炎活性研究标明，海燕皂苷具有显著的抗炎活性。 抑菌实验结果显示：海燕皂苷对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、啤酒酵母无明显的抑菌活性，结果与其它文献报道的抑菌活性结论不一致，具体原因有待于进一步深入研究。 海燕皂苷可以明显抑制肝癌、胃癌、前列腺癌、结肠癌、食管癌、神经胶质瘤和白血病等多种肿瘤细胞的增殖，对H22肝癌、Lewis肺癌、U14宫颈癌和B16黑色素瘤的生长亦有显著的抑制作用。 海燕皂苷对脑缺血损伤有显著的保护作用，进一步的研究发现：抑制Ca2+超载，抗脂质过氧化，保护线粒体膜结构与功能的完整，改善脑能量代谢是海燕皂苷发挥其抗缺血性脑损伤的作用机制之一。 采用溶剂浸提和硅胶柱层析相结合的方法，提取并精制得到了海燕精制油脂，得率为1.64％；气相色谱分析表明，海燕精制油脂中多不饱和脂肪酸总量在40％以上，其中，EPA+DHA总量在20％以上，高于市售深海鱼油中EPA+DHA的含量(17.308％)，此外，海燕油中还富含十八碳三烯酸(C18：3)、二十二碳五烯酸(C22：5)等多不饱和脂肪酸，由此可见，黄海产海燕是提取EPA、DHA等多不饱和脂肪酸的良好来源。 碱提法能有效从海燕中提取酸性粘多糖，粗品为黄褐色粉末，可溶性良好。双氧水可有效脱色；Sevag法脱蛋白效果较好，糖含量57.1％，蛋白含量13.8％；二次酶解可有效去除结合蛋白，糖含量63.2％，蛋白含量7.0％。乙醇分级沉淀得到海燕多糖Ⅰ、多糖Ⅱ、多糖Ⅲ、多糖Ⅳ，糖含量分别为20.6％、20.7％、29.2％和19.9％，蛋白含量分别为29.2％、27.8％、59.5％和65.7％。多糖Ⅰ为酸性粘多糖，含有硫酸根，含有醛糖残基，不含酮糖，由三个组分构成，平均分子量约为10kD，且电荷分布较为均一。其它多糖的组分及种类有待于进一步的深入研究。 海燕生殖腺中蛋白质含量为43.25％，总氨基酸中必需氨基酸含量为36.24％，粗脂肪含量为14.22％，矿质元素含量丰富，可用作高营养、无毒的新型海洋功能食品原料，具有开发利用价值。 综上所述，我国黄渤海海域自然资源储量丰富的底栖棘皮动物海燕含有海燕皂苷、酸性粘多糖、多不饱和脂肪酸等多种生物活性物质；蛋白质、脂肪、氨基酸、矿质元素等营养成分丰富；利用现代生化提取分离技术，可以有效的制备纯化海燕皂苷、酸性粘多糖、多不饱和脂肪酸等生物活性物质；通过对海燕皂苷的活性评价研究表明：海燕皂苷具有显著的祛痰、镇咳、平喘作用；抗炎活性明确；抗肿瘤效果广谱；同时对脑缺血损伤有显著的保护作用。作为一种潜在的药用和食用海洋生物资源，海燕具有巨大的开发利用价值。

目录

文摘

英文文摘

第一章文献综述及立论依据

第一节棘皮动物天然活性物质研究进展

1.1海参纲动物天然活性物质研究

1.2海星纲动物天然活性物质研究

1.3海胆纲动物天然活性物质研究

1.4蛇尾纲动物天然活性物质研究

1.5海百合纲动物天然活性物质研究

第二节棘皮动物氨基多糖的提取与活性研究进展

2.1氨基多糖的提取、分离及测定

2.2氨基多糖的医学功能

第三节海星皂苷及其它活性成分研究进展

3.1海星皂苷的组成、结构与分布

3.2海星皂苷的生物活性

3.3甾醇类化合物

3.4氨基酸和多肽

3.5多糖

3.6糖蛋白

3.7脂类

3.8胶原蛋白

3.9其它成分

第四节本研究的立论依据

4.1研究意义

4.2国内外研究现状

4.3主要创新点

4.4主要经济与社会效益

第二章海燕皂苷的提取、分离纯化及其分析鉴定

2.1海燕皂苷的提取

2.1.1材料与方法

2.1.2结果与讨论

2.2海燕组织中皂苷的分布研究

2.2.1材料与方法

2.2.2结果与讨论

2.3海燕皂苷的分离与鉴定

2.3.1材料与方法

2.3.2结果与讨论

2.4本章小结

附图

第三章海燕皂苷生物活性的实验研究

3.1海燕皂苷的祛痰活性

3.1.1材料与方法

3.1.2祛痰实验

3.1.3祛痰活性测定结果

3.2海燕皂苷对浓氨水致咳小鼠的影响

3.2.1材料与方法

3.2.2结果与讨论

3.3海燕皂苷对组胺致喘豚鼠的作用

3.3.1材料与方法

3.3.2结果与讨论

3.4海燕皂苷对小鼠急性炎症的治疗作用

3.4.1材料与方法

3.4.2结果与讨论

3.5海燕皂苷对二甲苯所致小鼠耳肿胀的影响

3.5.1材料与方法

3.5.2结果与讨论

3.6海燕皂苷对新鲜鸡蛋清所致大鼠足跖肿胀的治疗作用

3.6.1材料与方法

3.6.2结果与讨论

3.7海燕皂苷对大鼠棉球肉芽肿的影响

3.7.1材料与方法

3.7.2结果与讨论

3.8海燕皂苷对小鼠流感性肺炎的治疗作用

3.8.1材料与方法

3.8.2结果与讨论

3.9海燕皂苷的抗菌活性

3.9.1实验材料

3.9.2抑菌实验

3.9.3抑菌活性测定结果

3.10海燕皂苷抑制体外培养肿瘤细胞的增殖作用

3.10.1材料与方法

3.10.2实验结果

3.10.3结论

3.11海燕皂苷抑制小鼠体内移植瘤生长及延长荷瘤小鼠生存期作用

3.11.1实验材料

3.11.2实验方法

3.11.3实验结果

3.12海燕皂苷对大鼠局部脑缺血损伤的保护作用

3.12.1材料

3.12.2方法

3.12.3结果

3.12.4讨论

3.13海燕皂苷对脑缺血所致大鼠脑线粒体损伤的保护作用

3.13.1材料

3.13.2方法

3.13.3结果

3.13.4讨论

3.14本章小结

第四章海燕多不饱和脂肪酸的提取与性质

4.1材料与方法

4.1.1材料

4.1.2仪器与试剂

4.1.3色谱条件

4.1.4实验方法

4.2结果与讨论

4.2.1产油率的计算

4.2.2石油醚部分的脂肪酸组成分析

4.2.3乙酸乙酯部分的不饱和脂肪酸组成分析结果

4.2.4市售深海鱼油的不饱和脂肪酸组成

4.3本章小结

第五章海燕酸性粘多糖的分离纯化及鉴定

5.1材料与方法

5.1.1材料

5.1.2海燕中酸性粘多糖的提取方法

5.1.3糖含量及蛋白质含量的测定

5.1.4硫酸基鉴定及多糖的琼脂糖凝胶电泳

5.1.5离子交换层析

5.1.6分子筛层析

5.1.7多糖分子量的测定及颜色反应

5.1.8 Sevag法脱蛋白

5.2结果与讨论

5.2.1海燕多糖组分表观性状

5.2.2糖含量及蛋白质含量的测定结果

5.2.3硫酸基的测定及琼脂糖凝胶电泳测定结果

5.2.4离子交换层析的洗脱曲线

5.2.5分子筛层析

5.2.6多糖分子量的测定结果及颜色反应

5.2.7 Sevag法脱蛋白

5.3本章小结

第六章海燕生殖腺中几种营养成分的含量测定及毒性分析

6.1材料与试剂

6.2方法

6.2.1蛋白质的测定

6.2.2粗脂肪的测定

6.2.3氨基酸的测定

6.2.4无机矿质元素的测定

6.2.5水分的测定

6.2.6灰分的测定

6.2.7毒理学研究

6.3结果与讨论

6.3.1海燕生殖腺中蛋白质、粗脂肪及脂肪酸等含量测定结果

6.3.2海燕生殖腺氨基酸含量测定结果

6.3.3海燕生殖腺微量元素含量测定结果

6.3.4毒性分析

6.4本章小结

参考文献

论文总结

致谢

附录Ⅰ博士论文工作期间发表论文及获得专利等情况

附录Ⅱ专利申请受理通知书