肌醇和磷脂酰肌醇在酒精酵母解阻遏突变株蔗糖酶分泌调控中的作用

摘要

在酵母菌中，肌醇作为膜磷脂中磷脂酰肌醇合成的前体与CDP-二酰基甘油(CDP-DAG)反应生成磷脂酰肌醇(PI)。磷脂酰肌醇及其各种磷酸化的衍生物在酵母细胞的生命活动中发挥着重要的作用，尤其是衍生物中的磷脂酰肌醇4，5-二磷酸(PIP2)，在对磷脂酰肌醇具有特异性的磷脂酶C酶解作用下产生的肌醇三磷酸(IP3)和二酰基甘油在酵母细胞中具有第二信使的功能，参与细胞的许多代谢调节作用。另一方面，MIG1基因是葡萄糖阻遏作用过程中一个非常重要的基因，它编码的Mig1蛋白对酒精酵母蔗糖酶基因的表达与蔗糖酶的分泌具有重要的调控作用。西班牙的Gancedo教授提出了Snf1-Mig1模型来解释酒精酵母菌中Mig1蛋白质是如何在分子水平上阻遏有关基因表达和Mig1蛋白如何在高浓度葡萄糖存在的情况下活性发生变化的。我们前期研究结果表明细胞膜中PI的含量对酒精酵母的蔗糖酶分泌存在调控作用，而这种调控作用是通过PI的信号传导途径介导Snf1-Mig1这一模式而实现的。本文利用已经得到的酒精酵母解阻遏突变株mig1△、mig2△和mig1△mig2△(分别命名为YM4725，YM4664和YM4738)以及携带相关基因的质粒来研究Mig1和Mig2对酒精酵母蔗糖酶分泌的调控作用和PI类信号传导是否通过Snf1-Mig1这一调控模式来调控蔗糖酶的分泌。 首先，利用解阻遏突变株来研究Mig1和Mig2对酒精酵母蔗糖酶分泌的调控作用、细胞膜中PI的含量与蔗糖酶分泌、以及PI含量与Mig1和Mig2蛋白之间的关系。实验的结果发现Mig1和Mig2都对酒精酵母的蔗糖酶分泌存在着明显的调控作用，而且Mig1的调控作用要强于Mig2的调控作用。另一方面，在三种解阻遏突变株中，培养基中添加肌醇与否对细胞膜中PI的生物合成产生了明显的影响(生长在添加肌醇(100μg/ml)培养基中的细胞细胞膜中PI的含量要明显的高于生长在不添加肌醇培养基中的细胞)，而对于蔗糖酶的分泌却基本不存在影响，说明PI的含量对酒精酵母的蔗糖酶分泌的调控作用可能是通过Mig1-Snf1这一调控模式来实现的。由于MIG1和MIG2基因的缺陷，导致不能合成Mig1和Mig2，PI类信号传导失去了“中间站”，因此不能对蔗糖酶分泌产生调控作用。 然后将携带有基因MIG1和MIG2等的质粒分别转化入各自的解阻遏突变株中，得到的转化菌株分别命名为YM4725’，YM4664’和YM4738’。利用转化子来进一步研究确定Mig1和Mig2对酒精酵母蔗糖酶分泌的调控作用以及细胞膜中PI的含量与蔗糖酶分泌和Mig1和Mig2之间的关系。实验结果指出，转化子的蔗糖酶比活要远远小于其各自的解阻遏突变株，尤其是YM4738’蔗糖酶比活要较YM4738小20倍多。说明Mig1和Mig2都对酒精酵母的蔗糖酶分泌存在着明显的调控作用。而在添加与不添加肌醇两种情况下，转化子的细胞膜中的PI的含量与解阻遏突变株的并没有多大的差别，但是由于MIG1和MIG2的表达，编码产生了Mig1和Mig2，PI含量的不同对蔗糖酶的分泌产生明显的影响。由此可以确定细胞膜中PI的含量对酒精酵母的蔗糖酶分泌存在调控作用，而这种调控作用是通过PI的信号传导途径介导Mig1-Snf1这一调控模型而实现的。

目录

文摘

英文文摘

第一章文献综述

1酒精酵母菌磷脂酰肌醇(PI)生物合成及其重要的生理学功能

1.1酒精酵母中磷脂酰肌醇的生物合成

1.2 PI的生物学功能与PI的信号传导途径

2酵母菌中的葡萄糖阻遏作用

2.1葡萄糖阻遏调控的机制

2.2酵母中其他的葡萄糖信号传导途径

3 PI类信号传导与葡萄糖阻遏的关系

4本文的研究重点与意义

第二章肌醇和磷脂酰肌醇对酒精酵母菌解阻遏突变株蔗糖酶分泌的调控作用

1材料与方法

1.1菌株

1.2培养基

1.3酵母细胞培养及培养条件

1.4细胞浓度的测定

1.5细胞干重的测定

1.6酵母细胞胞外蔗糖酶活性的测定

1.7脂类的提取及磷脂的分析

2实验结果与讨论

2.1对Migl △解阻遏突变株(YM4725)的研究

2.2对Mig2△解阻遏突变株(YM4664)的研究

2.3对Migl△Mig2△解阻遏突变株(YM4738)的研究

3结论

第三章肌醇和磷脂酰肌醇对酒精酵母菌解阻遏突变株转化子蔗糖酶分泌的控作用

1材料与方法

1.1菌种与质粒

1.2培养基与培养条件

1.3尿嘧啶缺陷型的筛选方法

1.4解阻遏突变株的转化方法

1.5细胞杂交的方法

1.6其它方法

2实验结果与讨论

2.1尿嘧啶缺陷型的确定与筛选

2.2质粒pBM2606和pBM24433的电泳图

2.3 菌株YM4725尿嘧啶缺陷型和YM4664的质粒转化和转化子的筛选

2.4转化子YM4664’与转化YM4725’的杂交及杂交细胞的筛选

2.5对转化子YM4725’的研究

2.6对转化子YM4664’的研究

2.7融合子YM4738'的研究

3结语

第四章结束语

1本文的创新点与 PI介导的葡萄糖阻遏的调控模型的建立

2 PI信号传导与葡萄糖解阻遏和蔗糖酶基因表达的关系

参考文献

致谢