弧菌属16S核糖体RNA基因特异引物的设计优化及其在胶州湾海洋弧菌菌群结构分析中的应用

摘要

弧菌是海洋环境中最常见的细菌类群之一。弧菌属的一些种是致病菌，能引起海洋生物弧菌病，以水产品为中间宿主，一些弧菌可引起人类腹泻、菌血症和外伤感染，严重时可以致死。弧菌是条件致病菌，水产养殖业弧菌病的发生与水体中弧菌的总数无线性关系，而是由弧菌属的结构组成——即致病菌的数量决定的。目前弧菌多样性的研究仍局限在传统的分离培养的技术路线上；由于环境微生物宏基因组复杂度高，现有技术的分析容量有限，基于UPPCR的16SrRNA分子多样性研究只能在较高的分类阶元进行分析，而不能准确描述某一属甚至科内的多样性构成。因此，突破传统的纯培养技术限制，在分子水平上研究环境样品中弧菌属的组成和弧菌菌群动态变化对于水产养殖安全和食品安全有着重要意义。 DNA提取是整个环境微生物基因组研究的基础，能否获得具有代表性的DNA将决定后续分析的可信性。本研究第一部分介绍了一种制备海洋浮游生物PCR模板DNA的方法——碱煮法。使用该方法制备的模板DNA溶液pH值在8到9之间，可直接用于核糖体RNA、叶绿体rbcL和线粒体COI等基因的PCR扩增。第二部分中，以16SrRNA基因为指示基因，结合弧菌属的近缘种序列，利用引物3’端2-4个碱基特异性起始PCR反应的性质，在弧菌属16SrDNA的保守区设计特异引物VF169，VR744和VR1150。根据引物对的严谨性和弧菌属内通用性设计不同组合，通过特异PCR选择性扩增环境样品中弧菌属16SrDNA片段并构建16SrDNA序列变异类型文库；随机筛选克隆进行测序(共测序72个)，构建系统树分析胶州湾近岸水体中弧菌属的组成。另外，通过菌株扩增实验和序列的BLAST分析验证了引物的特异性和弧菌属内通用性。 研究结果表明，设计的引物VR744表现出很强的弧菌属特异性，同时可以扩增绝大多数已知弧菌菌种，配合细菌通用引物VF27可从环境样品总DNA选择性扩增弧菌属16SrDNA；系统学分析显示72个序列都与已知的弧菌属细菌的序列聚类，具有很高的相似性，可以推断秋季胶州湾海域弧菌复杂度较高，类灿烂弧菌群是其中的优势菌群，占总弧菌的50％左右；但是因为弧菌属某些种类的16SrDNA序列存在种内变异大于种间变异的现象，16SrDNA不适合在种及种以下的水平分析弧菌属的多样性。 本论文提出的碱煮法快速、简便，适用于浮游生物分子遗传多样性研究；设计的弧菌属特异引物为在属的水平上监测环境样品中弧菌菌群动态变化以及定量研究致病弧菌的致病阈值打下基础；并且探索出一种相对普适的类群特异性引物设计模式。

目录

一、前言

1.海洋细菌的研究现状

2.弧菌和弧菌病的研究现状

二、本论文的立论依据和研究目的

三、弧菌属16S核糖体RNA基因特异引物的设计及其在胶州湾弧菌菌群结构分析中的应用

1.环境样品PCR模板DNA提取方法的优化——碱煮法

2.弧菌属16S rRNA基因特异引物的设计优化

3.胶州湾海洋弧菌菌群结构初步分析

4.结论

四、研究展望

参考文献

附录

硕士期间论文发表情况

致谢