海棒槌胶原蛋白的物理特性及其酶解物的生物活性研究

摘要

本文研究了一种低值的芋参科海参——海棒槌的基本组成；海参中胶原蛋白的提取方法，海参胶原蛋白的一些物理特性；海参胶原蛋白的酶解工艺及其酶解产物的分离纯化；海参胶原蛋白肽清除自由基等生物活性。 依据海参胶原蛋白的特性，本实验采用了酸法、酶促溶法和热水提取法三种方法进行海参胶原蛋白的制备，结果表明按照传统的酸法提取，几乎不能从海参中提取到胶原蛋白，而且即使有胃蛋白酶存在时，在低温条件下也很难提取到海参胶原蛋白，这与其它水产动物形成了鲜明对比。本实验中采用了两种提取方法：胃蛋白酶促溶法和热水抽提法，两种方法的提取率分别是29.2％和27.4％。从提取率来看，两种方法相差不大，但是酶促溶提取法的工艺相对繁琐，因此确定采用热水抽提法制备海参胶原蛋白。 两种方法提取的胶原蛋白的粘度特性有一定的差异，结果表明两种方法提取的胶原蛋白的粘度随着温度的升高而降低，随着浓度的增加而升高，但是在相同的条件下热水提取的胶原蛋白粘度较酶促溶法提取的要高。 本实验选用3942中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶四种酶对胶原蛋白进行水解。实验表明3942中性蛋白酶和菠萝蛋白酶对海参胶原蛋白的水解能力较强，由于3942中性蛋白酶具有广谱的水解特性，不利于酶解产物的控制和分离纯化，而菠萝蛋白酶具有一定的特异性，主要水解蛋白质、肽和酰胺的Lys-、Arg-、Phe-、Tyr-羧基端。因此本实验中确定选择菠萝蛋白酶作为实验用酶。 在单因素试验的基础上采用正交试验，以酶解产物清除超氧阴离子的活性为指标，对菠萝蛋白酶水解海参胶原蛋白的条件进行优化，最终确定海参胶原蛋白的最佳酶解工艺条件为A3B2C3D2E2，即最佳工艺条件为：酶解温度40℃，加酶量0.8％，底物浓度18mg/100ml(以羟脯氨酸计)，缓冲液pH5.2，酶解时间为4h。在此条件下所得产物对超氧阴离子自由基的清除率可达到52.20％。 本实验利用邻苯三酚(PR)自氧化法测定海参胶原蛋白肽清除O2·-的能力，利用水杨酸法测定海参胶原蛋白肽清除·OH的能力，以清除2·-和·OH自由基的能力为指标，利用超滤、柱层析等方法对所得的水解液进行分离纯化，筛选活性最高的组分。实验结果表明活性较强的成分是一些分子量较小的肽，因此利用截留分子量5k的超滤膜进行超滤，去除分子量较大的成分，然后将滤液上SephadexG-25凝胶柱进行分离，得到四个峰，其中峰Ⅲ和峰Ⅳ组分中几乎没有肽存在，峰Ⅰ和峰Ⅱ都具有一定的清除自由基能力，两者对O2·-的清除率分别为3.86％和29.02％，对·OH自由基的清除率分别为58.42％和75.41％，均具有极显著差异。 为了进一步研究海参胶原蛋白肽的生物活性，本实验以兔肝建立动物模型考察了海参胶原蛋白肽对兔肝组织及兔肝线粒体的保护作用。结果表明海参胶原蛋白肽对肝组织和线粒体均有一定的保护作用，作用机理与其具有清除自由基的能力有关。

目录

文摘

英文文摘

0前言

1海棒槌基本成分分析

1.1材料与方法

1.2结果与讨论

2海棒槌胶原蛋白的提取及其粘度特性研究

2.1材料与方法

2.2结果与讨论

3海棒槌胶原蛋白的酶解工艺确定

3.1材料与方法

3.2结果与讨论

4海棒槌胶原蛋白肽的分离纯化及其清除自由基活性

4.1材料与方法

4.2结果与讨论

5海棒槌胶原肽的生理活性研究

5.1材料与方法

5.2结果与讨论

6总结

参考文献

致谢