牡蛎酶解产物胰蛋白酶抑制活性的研究

摘要

本文研究了太平洋牡蛎的酶解条件及其酶解产物对胰蛋白酶活性的抑制作用。选取胃蛋白酶、胰蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、3942中性蛋白酶、Alcalase碱性蛋白酶等对牡蛎进行水解，以水解液中氨基酸态氮(AAN)的含量为指标，确定了3种水解效果较好的酶：Alcalase碱性蛋白酶、胰蛋白酶和菠萝蛋白酶。利用单因素试验和正交试验分别对这三种酶单独水解牡蛎的条件进行了研究，得出三种酶水解牡蛎的最佳条件分别为Alcalase：温度50℃，pH8.5，料水比(W/V)1：3，加酶量1200U/g，时间4h；胰蛋白酶：温度45℃，pH8.1，料水比1：3，加酶量1200U/g，时间4h；菠萝蛋白酶：温度50℃，pH5.5，料水比1：3，加酶量1400U/g，时间6h；为牡蛎生物活性肽的开发提供了基础参考数据。在此基础上研究了牡蛎的复合酶解条件，确定最佳的复合条件为：料水比1：3，体系最初pH为8.5，温度50℃，加入Alcalase600U/g水解3h，然后调节pH到5.5，加入菠萝蛋白酶700U/g继续水解3h，灭酶。另外还研究了酶解之前牡蛎肉的热变性处理对水解效果的影响。 建立了胰蛋白酶抑制活性的测定方法，采用5K、3K和1K的超滤膜把水解液分成4个组分，测定了不同分子量范围的超滤液的胰蛋白酶抑制活性。用分子筛层析对水解液不同组分进行了进一步分离，并测定了每个洗脱峰的活性，结果表明分子量较大的肽组分对胰蛋白酶的抑制作用比较强。选取不同的酶处理时间，研究了酶解时间长短与水解液胰蛋白酶抑制活性的关系，水解时间越长水解液对胰蛋白酶的抑制活性就越低。对不同组分的水解液进行了紫外扫描并作了光谱分析，对抑制活性较高的复合水解2h组分和牡蛎直接提取液进行了进一步层析分离，结果表明第一个洗脱峰对胰蛋白酶的抑制作用最强。复合酶水解2h组分过SephadexG-25柱得到第一个峰的IC50是1.894mg/ml，直接提取液过层析柱得到第一个峰的IC50是0.658mg/ml。 对牡蛎提取物不同组分进行了氨基酸分析和SDS-PAGE电泳分析。牡蛎直接提取液中蛋白质种类繁多，主要含有32.6KD、27.8KD、21-22KD、15-16KD等几种蛋白质，而经过水解以后提取物中的主要成分有31KD和33KD两种。

目录

0前言

0.1鱼贝类活性肽的研究现状

0.2牡蛎提取物生理功能的研究进展

0.3胰蛋白酶抑制剂与肿瘤的关系

0.4海洋生物中蛋白酶抑制剂的研究概况

0.5本课题研究目的和意义

1牡蛎酶解条件的研究

1.1酶活力测定

1.2最佳水解酶种的筛选

1.3热处理对酶解的影响

1.4单酶水解条件的优化

1.5复合酶水解条件的研究

2牡蛎酶解产物胰蛋白酶抑制活性的研究

2.1胰蛋白酶抑制剂活性测定方法的建立

2.2不同水解产物抑制活性的测定

2.3水解时间对产物抑制活性的影响

2.4水解产物的光谱分析

2.5抑制剂活性肽的分离纯化及其活性测定

3胰蛋白酶抑制剂活性肽的氨基酸分析及电泳分析

3.1氨基酸分析

3.2 SDS-PAGE电泳

4总结

参考文献

致谢