龙须菜世代差异表达基因和泛素基因的克隆及功能分析

摘要

龙须菜已经成为我国继海带和紫菜后的第三大栽培海藻，不仅是江蓠属的一个重要的产琼胶物种，而且还是一种遗传学研究的好材料。因此，对龙须菜进行基础研究，具有重要意义。本论文构建了龙须菜四分孢子体和雌配子问正反向抑 制性消减杂交(SSH)文库，分离了两世代间差异表达的基因，并对其中若干基 因进行了功能研究。 本研究选取正反向SSH文库中各384个克隆进行斑点杂交筛选，筛选出14个在两世代间差异表达的基因，序列测定后提交到NCBI网站上GenBank数据库，序列登录号为DQ008074-87。其中的7条序列分别与编码小GTP结合蛋白(Small GTPase)即小G蛋白、天冬氨酸转移酶、GMP合成酶、硫胺素焦磷酸化酶、R42蛋白和两种未知功能蛋白有同源性，而其余7条序列没有找到与其相匹配的基因。Virreal Northern杂交实验进一步证实了14个基因中的11个在两世代间呈现表达差异，其中7个是四分孢子体中上调表达的基因，3个在雌配子体中上调表达以及1个四分孢子体特异表达的基因。 论文中选择了SSH文库中在雌配子体中上调表达的小G蛋白基因和一个在四分孢子体中特异表达的基因，进行cDNA全长序列的分离及功能分析。序列比对后发现，该龙须菜小G蛋白尤其与动物来源的Rabll有较高的同源性。在小G蛋白基因的RACE反应中，PCR扩增出两种小G蛋白基因转录物。测序后将二者与其基因组序列比较后发现，其中一个是mRNA前体加工过程中的中间体，另一个是成熟的mRNA，前者只剪切掉了一个内含子，而在成熟mRNA分子中 两个内含子均被剪切掉了。Rab基因的两种转录物序列及其在基因组上的序列均提交到NCBI网站，GenBank序列登录号分别为DQ062156、AY904354和DQ019225。Southem杂交结果表明该基因在龙须菜基因组中可能是单拷贝的。我们还利用两种原核表达载体(融合表达载体pGEX和非融合表达载体 DBV220)，在大肠杆菌中表达了龙须菜小G蛋白，对融合重组表达产物进行了抗原性及其抗血清的免疫特异性分析。结果表明该重组蛋白具有很强的免疫原性和 免疫特异性。利用Western杂交技术对两种表达产物进行体外GTP结合性分析，实验结果表明这两种重组蛋白均具有GTP结合活性。我们还从文库中选取了一个四分孢子体特异表达基因(克隆SSH466)，分离了cDNA全长序列，GenBank 序列登录号DQ019223。序列同源性分析表明，该基因是一个未知功能基因。蛋白模体分析表明陔基因编码的多肽可能是一种内在膜蛋白。 另外，我们还克隆了龙须菜融合泛素基因、多聚泛素基因及多聚泛素基因的上游调控序列，并进行了序列分析及两基因在四分孢子体和雌配子体表达的初步研究。三条序列经测定后提交到NCBI网站上GenBank数据库，序列登录号分别为DQ019224、AY957885和DQ333344。泛素基因序列及其氨基酸序列的比对结果表明，龙须菜融合泛素的保守性较多聚泛素差，但二者的进化地位基本一致，红藻多聚泛素基因内部存在一定程度的趋同进化。两泛素基因在龙须菜雌配子体与四分孢子体中呈现出表达差异，融合泛素基因在两者的表达量相当，而多聚泛素基因在前者的表达量较后者低很多，与减数分裂有关的生命活动过程可能影响了多聚泛素基因的表达，使其表达呈现上调。多聚泛素基因上游调控序列分析结果表明该序列没有内含子。启动子预测结果表明在429-479bp处有一条可信度为1．OO的核心启动子。转录调控因子分析结果表明该序列有多种转录调控因子，主要是一些与胁迫条件相关，或是在某个特定发育阶段调控表达的元件，其余还有一些是植物特有的，如在光控基因等的调控序列中发现的保守元件。 本研究获得的这些差异表达基因是与龙须菜世代形成过程密切相关的基因，研究这些基因的功能对江蓠属海藻发育的分子机理的认识具有重要意义，并会为红藻进化研究提供参考资料。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩写表

独创声明及学位论文版权使用授权书

前言

第一章文献综述

第二章龙须菜雌配子体与四分孢子体差异表达基因的分离与鉴定

第三章龙须菜Rab基因和克隆SSH466cDNA全长序列的分离及功能分析

第四章龙须菜泛素基因的克隆、序列分析及表达的初步研究

总结

参考文献

附录

致谢

文章发表情况