注射用灰树花倍他葡聚糖质量标准及指纹图谱研究

摘要

灰树花(Grifola frondosa)是一种具有独特的芳香气味，营养丰富，药食兼用的珍稀菌类。从其菌丝体中提取的灰树花多糖具有良好的免疫调节和抗肿瘤活性。本论文所研究的注射用灰树花倍他葡聚糖(Grifola frondosa beta-glucan forinjection，GFGI)是以灰树花发酵菌丝体经热碱提取的β-葡聚糖为原料、以甘露醇为辅料经冷冻干燥而成的一种无菌制剂，临床上拟用于恶性肿瘤和免疫缺陷症的辅助治疗。 本论文在对GFGI的基本理化性质进行研究的基础上，分别对GFGI的定性鉴别方法、含量及含量均匀度测定的方法学、分子量及分子量分布测定的方法学及影响因素、降解产物分析方法等方面进行了较为系统的研究，拟订了GFGI的质量标准草案。按照国家药品与食品监督管理局制定的《中药注射液指纹图谱技术要求》中的要求，分别采用凝胶渗透色谱(HPGPC)法和反相高效液相色谱(RP-HPLC)法对GFGI的药材、中间体、制剂的指纹图谱进行了系统的研究，建立了既反映GFGI活性成分灰树花倍他葡聚糖，又反映药材中的其他化学成分指纹特征的药材指纹图谱(1)和指纹图谱(2)，并拟订了GFGI药材、中间体和注射剂的指纹图谱检测标准草案。 在质量标准研究中，本论文建立了GFGI的含量及含量均匀度测定的HPGPC法，该方法专属性强，重现性好，GFGI在0.2-5.0 mg·mL<'-1>浓度范围内与峰面积和峰高均呈良好的线性关系，且辅料对测定结果无干扰；同时，本论文还采用硫酸一苯酚法对GFGI的含量及含量均匀度测定进行了研究，发现采用以含处方量甘露醇的葡萄糖制作标准曲线，可消除辅料的干扰，具有良好的精密度和重现性，但操作较HPGPC法繁琐，专属性较差。 本论文建立了GFGI的分子量(Mr)及分子量分布测定方法，并对GFGI的Mr测定结果的影响因素进行了研究。结果表明：流动相对GFGI的色谱行为和Mr测定结果有着很大的影响，分别以纯水、0.02％NAN<,3>、0.1mol·L<'-1>NaNO<,3>和0.1mol·L<'-1>Na<,2>SO<,4>溶液为流动相进行测定，GFGI的Mr依次为822410、177520、29112和25066道尔顿，其中以0.02％NaN<,3>水溶液为流动相时，色谱峰的对称性好，与辅料有适宜的分离度。色谱柱对GFGI的Mr测定结果有十分明显的影响，采用TSK柱进行测定时，其Mr结果低于SSB柱10％以上；上样浓度、上样体积和测定温度均对GFGI的Mr测定结果具有明显的影响，但辅料甘露醇的比例对Mr的测定结果无明显的影响；分别采用安捷伦公司、龙智达公司的GPC软件进行计算，对Mr的测定结果无明显的影响。 另外，本论文还建立了适合GFGI降解产物考察的HPGPC方法，GFGI经高温105℃破坏后，采用HPGPC方法可以检测到样品分子骨架发生断裂后出现的低聚糖或寡糖等少量降解产物的产生。在指纹图谱研究中，本论文采用HPGPC法建立了反映GFGI的活性成分灰树花倍他葡聚糖的药材指纹图谱(1)；采用RP-HPLC建立了反映药材中的其他化学成分指纹特征的药材指纹图谱(2)。在药材指纹图谱(1)中，当采用示差折光检测器(RID)进行检测时，可检出7个较为明显的指纹图谱峰，十批药材的相似度均在0.95以上；在药材指纹图谱(2)中，采用二极管阵列检测器(DAD)进行检测时，可检出稳定性较好、吸收较强的16个共有峰，十批药材的相似度在0.90以上。本论文确定了两张指纹图谱中供试液的制备方法，对色谱条件进行了优化，对方法的稳定性、精密度和重复性等进行了研究，并采用与药材指纹图谱(1)相同的色谱条件，建立了GFGI中间体与制剂的指纹图谱。 结果表明，本论文建立的指纹图谱检测方法具有良好的稳定性和可靠性，能较好地反映药材、中间体与制剂中活性成分的相关性，可用于对GFGI药材、中间体及制剂的质量进行控制。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

1灰树花多糖研究概述

2多糖类药物的质量标准研究

3中药指纹图谱研究概述

4本论文研究目的及意义

第一章注射用灰树花倍他葡聚糖的基本理化性质研究

1材料与仪器

2方法与结果

2.1原料药灰树花倍他葡聚糖的提取工艺

2.2性状

2.3鉴别

2.4检查

2.5降解产物分析

3小结

第二章含量及含量均匀度的测定

1材料与仪器

2高效凝胶渗透色谱法测定含量

2.1方法与结果

2.2讨论

3硫酸-苯酚法测定含量

3.1实验方法

3.2结果与讨论

3.3结论

4含量均匀度测定

4.1 HPGPC法对含量均匀度的测定

4.2硫酸苯酚法对含量均匀度的测定

5小结

第三章分子量与分子量分布的测定及影响因素

1材料与仪器

2实验方法

2.1分子量、分子量分布测定

2.2不同色谱条件对GFGI分子量测定的影响

3结果与讨论

3.1分子量和分子量分布测定结果

3.2流动相对Mr测定结果的影响

3.3色谱柱对Mr测定结果的影响

3.4上样量对Mr测定结果的影响

3.5温度和辅料比例对Mr测定结果的影响

3.6方法的精密度与重现性

4小结

第四章质量标准草案及起草说明

1注射用灰树花倍他葡聚糖的质量标准草案

2质量标准草案起草说明

2.1有关性状说明

2.2鉴别说明

2.3检查项目说明

2.4含量测定方法说明

第五章注射用灰树花倍他葡聚糖药材的指纹图谱

1材料与仪器

2药材指纹图谱检测标准草案

3药材指纹图谱检测标准草案的起草说明

3.1名称、汉语拼音

3.2来源

3.3供试品溶液的制备

3.4参照物溶液的制备

3.5指纹图谱(1)色谱条件的选择

3.6指纹图谱(2)色谱条件的选择

3.7方法的稳定性及精密度试验

3.8方法的重现性试验

3.9指纹图谱(1)及其技术参数

3.10指纹图谱(2)及其技术参数

4小结

第六章中间体、制剂的指纹图谱

1中间体指纹图谱检测标准草案

2中间体指纹图谱检测标准(草案)的起草说明

2.1名称、汉语拼音

2.2来源

2.3供试品溶液的制备

2.4参照物溶液的制备

2.5色谱条件的选择

2.6方法的稳定性及精密度试验

2.7方法的重现性试验

2.8指纹图谱及其技术参数

3注射剂指纹图谱检测标准(草案)

4注射剂指纹图谱检测标准草案的起草说明

4.1名称、汉语拼音

4.2来源

4.3供试品溶液的制备

4.4参照物溶液的制备

4.5色谱条件的选择

4.6方法的稳定性及精密度试验

4.7方法的重现性试验

4.8指纹图谱及其技术参数

5药材、中间体和注射剂指纹图谱之间的相关性

6小结

结语

创新点

参考文献

硕士期间参与发表文章

致谢