仿刺参（Apostichopus japonicus）水溶性海参皂苷的分离纯化及其药理活性研究

摘要

皂苷(或皂甙)广泛存在于部分陆生植物和海洋棘皮动物海参和海星中，具有溶血、抗肿瘤、抗真菌、细胞毒、免疫调节、抑制Na<'+>-K<'+>-ATP酶等多种生理和药理学活性。海参体内富含的海参皂苷，是一类主要的次生代谢产物。目前，对海参皂苷的分离制备主要采用乙醇或甲醇等有机溶剂萃取法，但这类方法不仅有机溶剂使用量大、成本高、易污染环境、不适于工业化生产，而且所得海参皂苷制品的水溶性较差，限制了海参皂苷在医学临床上的应用途径和应用范围。遗憾的是，至今还未见到有关水溶性海参皂苷分离纯化及生物活性的研究报道。为此，本文以仿刺参(Apostichopus japonicus)为材料建立了其水溶性海参皂苷的提取方法，利用各种层析技术对水溶性海参皂苷进行了分离纯化，并对各种皂苷制品的抗菌活性进行了研究，利用体外培养的肿瘤细胞进行了抗肿瘤活性研究，并进行了抗氧化和驱蝇活性研究，旨在筛选出具有强抗真菌和抗肿瘤活性的水溶性海参皂苷纯化样品，为利用水溶性海参皂苷研制高效抗真菌、抗肿瘤及驱蝇药物创造条件。 利用正交实验对从冻干仿刺参加工废弃液中制备水溶性海参皂苷的技术工艺进行了优化，结果显示，从冻干仿刺参废弃液中分离制备水溶性海参皂苷的最佳技术工艺条件为：仿刺参废弃液pH值为10，AB-8大孔树脂柱的上样速率为2倍柱体积(BV)/h、洗脱用乙醇浓度为70％、洗脱体积为6 BV。该技术工艺具有操作简单、有机溶剂使用量少、适合于工业化生产等诸多特点，不仅可用于水溶性海参皂苷的大规模制备和生产，而且还充分利用了冻干仿刺参加工废弃液，有效避免了因该废弃液排放所造成的环境污染问题。 从冻干仿刺参废弃液中分离制备出的水溶性海参皂苷属于三萜皂苷；抑菌结果表明，水溶性海参皂苷对裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、酵母菌啤酒酵母(Saccharomyes cerevisiae)、白色念珠菌(Candidaalbicans)、葡萄炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)、黄瓜枯萎病原菌(Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum)和霉菌黑曲霉(Aspergillus niger)均具有显著的抑菌活性，其最低抑菌浓度MIC值分别为0.002、0.016、0.063、0.063、0.125和0.250 mg/mL，而对枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Eschetichia coli)和绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)均没有抑制作用；所得皂苷对体外培养的HeLa宫颈癌细胞、A-549肺癌细胞、SGC-7901胃癌细胞和Bel-7402肝癌细胞均具有显著的增殖抑制活性，IC<,50>值分别为16.39、13.98、14.51和15.29 μg/mL；浓度为20 mg/mL的皂苷在24 h内具有显著的驱蝇活性；所得皂苷没有明显的抗氧化活性。将所得水溶性海参皂苷再次上样于AB-8大孔树脂柱，分别利用30％、50％、70％、80％和95％进行洗脱，发现70％、80％和95％乙醇溶液洗脱组分不仅对6种真菌具有显著的抗真菌活性，而且对体外培养的4种癌细胞也均具有显著的抗肿瘤活性。 所得具有显著抗真菌活性和抗肿瘤活性的70％乙醇溶液洗脱组分，经硅胶柱层析和Sephadex LH-20柱层析进一步纯化后，获得了4种水溶性海参皂苷单体组分SCl-4，其中SC-2、SC-3和SC-4的纯度分别为99.6％、99.8％和96.2％；SC-2和SC-3具有极强的抗真菌和抗肿瘤活性，它们对裂殖酵母菌、啤酒酵母菌、白色念珠菌、葡萄炭疽病原菌、黄瓜枯萎病原菌和黑曲霉的MIC值相同，分别为0.25、4、8、<32、32和<32μg/mL；SC-2和SC-3对体外培养的HeLa细胞、A-549细胞、SGC-7901细胞和Bel-7402细胞具有极强的抗肿瘤活性，SC-2对4种癌细胞的IC<,50>值分别为3.23、4.13、4.41和3.04 μg/mL，SC.3的IC<,50>值分别为3.49、4.11、4.26和3.15 μg/mL。 利用S<,180>荷瘤小鼠对水溶性海参皂苷单体组分SC-2体内抗肿瘤活性的鉴定结果表明，剂量为2、5和10 μg/g体重的SC-2单体组分，能显著抑制小鼠S180实体瘤的生长，其对实体瘤的抑制率分别为33.88％、38.93％和47.84％；剂量为2、5和10 μg/g体重的SC-2单谇组分能显著提高S<,180>荷瘤小鼠的胸腺指数(P<0.01)，也能不同程度地提高S<,180>荷瘤小鼠的脾指数。利用体外培养HeLa细胞和吖啶橙/溴化乙锭双染色法对SC-2单体组分的抗肿瘤作用机理进行了初步研究，发现SC-2具有诱导HeLa细胞发生凋亡的能力，浓度为50 μg/mL时在12h内可诱导几乎所有细胞发生凋亡，且浓度为10和50 μg/mL SC-2处理12h后的HeLa细胞均出现了明显的DNA断片化。说明水溶性海参皂苷单体组分SC-2之所以具有抗癌活性，主要是通过诱导癌细胞发生细胞凋亡来实现的。 本文在国内外首次建立了制备水溶性海参皂苷的最佳技术工艺及其单体组分的纯化方法，分离纯化出具有极强抗真菌和抗肿瘤活性的水溶性海参皂苷单体组分，不仅可以作为纯天然新型海洋抗肿瘤药物和抗真菌药物研制的理想候选者，而且对其它海洋棘皮动物水溶性皂苷的分离纯化具有重要的指导价值，对于深入研究棘皮动物水溶性皂苷的性质及其药理活性也具有重要的科学意义。

目录

声明

摘要

第一章前言

1皂苷概述

2海参皂苷研究进展

2.1海参皂苷的分离制备及纯化

2.2海参皂苷的生物学活性

2.3海参皂苷的种类及化学构成

3海星皂苷研究概况

3.1多羟基甾体皂苷(polyhydroxysteroids glycosides)

3.2环式甾体皂苷(Cycle steroid glycosides)

3.3海星皂苷(Asterosaponins)

4本文研究的目的、实验设计、创新及意义

4.1本研究目的

4.2实验设计

4.3该课题主要创新点

4.4研究意义

第二章水溶性海参总皂苷的提取分离及生物活性研究

1材料与方法

1.1材料

1.2实验方法

2结果与分析

2.1水溶性海参总皂苷制品的性质鉴定

2.2抗真菌活性实验

2.3体外抗肿瘤活性实验

2.4水溶性海参总皂苷体外抗氧化活性实验

2.5驱蝇活性实验结果

2.6仿刺参加工废弃液水溶性海参总皂苷制备工艺的正交实验

3讨论

3.1水溶性海参总皂苷的提取分离

3.2水溶性海参总皂苷性质测定

3.3水溶性海参总皂苷的抑菌活性

3.4水溶性海参皂苷的体外抗肿瘤活性

3.5水溶性海参总皂苷抗氧化活性的研究

3.6水溶性海参总皂苷驱蝇活性

3.7利用冻干仿刺参废弃液制备水溶性海参皂苷的工艺优化

4结论

第三章水溶性海参总皂苷的部分纯化及抗真菌抗肿瘤活性的跟踪筛选

1材料与方法

1.1材料与试剂配制

1.2实验方法

2实验结果

2.1大孔树脂柱层析各组分得量

2.2大孔树脂洗脱组分的抗真菌活性筛选结果

2.3大孔树脂乙醇洗脱组分抗肿瘤活性筛选

3 讨论

4结论

第四章水溶性海参皂苷的纯化及高抗真菌和抗肿瘤活性组分的筛选

1材料与方法

1.1材料与试剂配制

1.2实验方法

2实验结果

2.1大孔树脂70％乙醇洗脱组分的硅胶柱层析图谱

2.2 Sephadex LH-20柱层析图谱

2.3纯化组分的性质鉴定结果

2.4水溶性海参皂苷纯化样品的纯度鉴定结果

2.5抗真菌活性

2.6抗肿瘤活性筛选

3讨论

3.1水溶性海参皂苷的分离纯化

3.2抗真菌活性的筛选

3.3体外抗肿瘤活性筛选

4结论

第五章水溶性海参皂苷纯品SC-2体内外抗肿瘤药理作用的实验研究

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2结果

2.1 SC-2体外对HeLa细胞的增殖作用

2.2 SC-2诱导体外培养的HeLa细胞凋亡

2.3 SC-2抗肿瘤的动物实验

3讨论

3.1水溶性海参皂苷SC-2体外抑制HeLa细胞增殖作用

3.2水溶性海参皂苷SC-2诱导HeLa细胞凋亡的作用

3.3水溶性海参皂苷SC-2的体内抗肿瘤动物作用

4结论

全文总结

参考文献

攻读博士学位期间发表及整理的专利和文章

致谢