高产褐藻酸酶菌株的筛选、发酵条件优化和褐藻酸酶酶学性质的初步研究

摘要

本研究以筛选高效产褐藻酸酶菌株、研究酶的生物学效应、酶学性质及酶法降解褐藻胶制备褐藻胶寡糖为基本目的和出发点，从海洋环境中分离筛选出一株高产褐藻酸酶的菌株s4。 本实验利用褐藻酸钠作为唯一的碳源从绿烂病海带的病烂处筛选分离得到一株高产褐藻酸酶的菌株s4并对其发酵条件进行了研究。结果表明：通过单次单因子实验确定褐藻酸降解菌株s4较优的产酶培养基主要成分的浓度为(w/v)：褐藻酸钠1.2％，氯化铵0.9％，NaCl 1.5％，较优的发酵产酶条件为：起始pH为7.5，25℃培养48h。 菌株s4在优化后的发酵培养基中25℃培养48h后，经离心、30％～90％的(NH<,4>)<,2>SO<,4>盐析分级沉淀、CM-Sepharose Fast Flow和Sephacryl S-100柱层析对褐藻酸酶进行纯化和精制，获得了电泳纯度的酶蛋白组分。SDS-PAGE确定其分子量为29kDa．该褐藻酸酶的最适作用温度和最适反应pH分别为40℃和7.0，酶活力在pH 6.0-9.0范围内和45℃以下时相对稳定。二价金属离子对褐藻酸酶的活性有不同程度的影响，其中Hg<'2+>对褐藻酸酶活力的抑止作用最为明显，而Mg<'2+>、Na<'+>和K<'+>均对酶活有促进作用。在40℃，pH7.5时降解底物，发现酶对底物有专一性，而且在一定范围内，酶促反应随着底物浓度的增大而增强。

目录

文摘

英文文摘

声明

0前言

1.引言

1.1立题背景和意义

1.2褐藻胶寡糖的功能研究进展

1.3褐藻胶的来源和结构性质

1.4褐藻胶的降解

1.5褐藻酸酶的研究进展

1.5.1褐藻酸酶的来源

1.5.2褐藻酸酶的分类

1.5.3褐藻酸酶的作用机制及底物专一性

1.5.4褐藻酸酶的酶活力测定方法

1.5.5褐藻酸酶的分离纯化

1.5.6褐藻酸酶的性质

1.5.7褐藻酸酶的结构与生物学功能

1.5.8褐藻酸酶的应用

1.6褐藻酸酶的应用发展前景展望

2高产褐藻酸酶菌株的分离、筛选

2.1.实验试剂与仪器设备

2.1.1主要试剂

2.1.2设备

2.2材料和方法

2.2.1培养基成分

2.2.2菌株的筛选

2.2.3褐藻酸酶活力的测定—改良DNS法

2.3实验结果

2.3.1DNS测定酶活力方法的改良

2.3.2初筛和复筛

2.4.1产褐藻酸酶微生物的筛选

2.4.2褐藻酸酶活力的测定

3产褐藻酸酶菌株s4发酵条件的研究

3.1实验材料与仪器设备

3.1.1菌种

3.1.2培养基

3.1.3试剂

3.1.4仪器和设备

3.2实验方法

3.2.1培养基最适碳源优化

3.2.2培养基最适氮源优化

3.2.3 NaCl浓度对产酶的影响

3.2.4培养基起始pH值对产酶的影响

3.2.5培养温度对产酶的影响

3.2.6装瓶量对产酶的影响

3.2.7摇床转速对产酶的影响

3.2.8发酵时间对产酶的影响

3.3.实验结果

3.3.1不同碳源对产酶的影响

3.3.2不同氮源对产酶的影响

3.3.3不同浓度氯化钠对产酶的影响

3.3.4培养基起始pH值对产酶的影响

3.3.5培养温度对产酶的影响

3.3.6装瓶量对产酶的影响

3.3.7摇床转速对产酶的影响

3.3.8发酵时间对产酶的影响

3.4小结

4褐藻酸酶的分离纯化

4.1实验材料与仪器设备

4.1.1菌种

4.1.3试剂

4.1.4仪器设备

4.2.实验方法

4.2.1褐藻酸酶粗酶的制备

4.2.2褐藻酸酶的纯化

4.2.3蛋白质纯度鉴定及分子量测定

4.3实验结果

4.3.1褐藻酸酶粗酶的制备

4.3.2褐藻酸酶的纯化

4.3.3蛋白质纯度鉴定及分子量测定

4.4小结

4.4.1关于褐藻酸酶粗酶的制备

4.4.2关于褐藻酸酶的纯化

5褐藻酸酶酶学性质的初步研究

5.1实验材料与仪器设备

5.1.1试剂

5.1.2仪器和设备

5.2实验方法

5.2.1褐藻酸酶理化性的研究

5.2.2底物对酶解反应的影响

5.2.3酶对底物的特异性分析

5.3实验结果

5.3.1褐藻酸酶理化性质的研究

5.3.2底物对酶解反应的影响

5.3.3酶对底物的特异性分析

5.4.小结

5.4.1关于褐藻酸酶的理化性质

5.4.2关于降解底物的分析

总结

参考文献

致 谢