交联型羧甲基壳聚糖的制备及其生物相容性与免疫佐剂活性研究

摘要

目的：羧甲基壳聚糖(Carboxymethyl chitosan，CM-CTS)是迄今为止所报道的600多种甲壳素衍生物中，研究最多的一种水溶性壳聚糖衍生物。研究证明，CM-CTS具有良好的生物相容性、生物降解性、降解可控性和抑菌性，它以其特有的理化性质已成为医药界及生物医学领域的研究热点。但CM-CTS在制备过程中要经过较长时间的浓碱高温等条件，故制成的CM-CTS的相对分子量和黏度会显著降低，作为医用高分子材料，在体内降解吸收太快，难以满足生物高分子材料的要求，因此在一定程度上限制了CM-CTS的应用范围。已有研究表明，CM-CTS具有一定的免疫调节作用。本研旨在探讨一种通过交联使CM-CTS黏度得到极大提高的的方法，并对其生物相容性及其作为免疫佐剂的应用前景进行研究。 方法：实验分四部分：1、对CM-CTS的制备、纯化方法及部分理化性质进行研究，通过细胞毒性和组织相容性对CM-CTS的生物相容性进行了初步评价。2、以戊二醛作为交联剂，通过对交联剂加入量、交联体系温度、pH值以及交联反应时间等交联条件的试验，确定了所需要的交联反应体系；对CM-CTS进行适度交联，制备了具有一定交联度且能溶于水的交联型羧甲基壳聚糖(C-CM-CTS)。对交联形成的西佛碱结构进行还原，制备了交联还原型羧甲基壳聚糖(D-CM-CTS)。3、以体外培养的小鼠成纤维细胞株L929为研究对象，对C-CM-CTS和D-CM-CTS进行细胞毒性评价，考查了二者的组织相容性。4、研究D-CM-CTS的溶血活性，通过MTT法测定了D-CM-CTS体外对Con A诱导的小鼠淋巴细胞增殖反应的影响。以不同剂量的D-CM-CTS联合卵清白蛋白(OVA)免疫小鼠，观察D-CM-CTS对OVA受免小鼠细胞免疫和体液免疫应答的影响。 结果：1、制备了高纯度，无菌无热原的CM-CTS，细胞毒性结果表明CM-CTS对L929成纤维细胞没有明显的毒性作用，并且对L929细胞增殖有一定的促进作用，其中以100μg/mL浓度对L929细胞的促增殖作用最为显著；肌肉注射8天后观察不到炎症细胞，说明CM-CTS具有良好的生物降解性和组织相容性。2、通过戊二醛和CM-CTS的适度交联，制备了黏度提高170倍且能溶于水的C-CM-CTS和D-CM-CTS。3、细胞毒性和组织相容性试验表明D-CM-CTS比C-CM-CTS具有更好的生物安全性，该结果为D-CM-CTS在生物医用材料、药物缓释载体等的研究和应用方面提供了一定的理论基础。4、溶血性实验表明D-CM-CTS没有溶血作用，D-CM-CTS在1-1000μg/mL浓度范围内对Con A诱导的小鼠T淋巴细胞的增殖反应有显著促进作用，其中1和10 μg/mL浓度促进作用极显著；不同剂量D-CM-CTS联合OVA免疫小鼠后，均能增强Con A和OVA诱导的OVA受免小鼠脾淋巴细胞增殖反应和提高OVA特异性抗体的效价水平，其中以2.5％组免疫效果最好。 结论：本研究制备的D-CM-CTS可将CM-CTS黏度提高170倍，无细胞毒性并能促进细胞增殖，且具有良好的生物相容性。将D-CM-CTS联合OVA免疫小鼠，证明D-CM-CTS具有良好的免疫佐剂活性。该研究结果为D-CM-CTS在生物医用材料、药物缓释载体等的研究和应用方面提供了理论基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语

声明

第一章文献综述

1羧甲基壳聚糖(Carboxymethyl chitosan,CM-CTS)

1.1羧甲基壳聚糖的制备

1.2羧甲基壳聚糖的结构性能

1.3羧甲基壳聚糖的应用

2免疫佐剂

2.1概述

2.2免疫佐剂的分类

2.3几类常用的佐剂及其作用机理

2.4关于免疫佐剂的研究的进展

3壳聚糖和羧甲基壳聚糖的免疫调节及佐剂效应

3.1壳聚糖的免疫调节作用

3.2壳聚糖的免疫佐剂效应

3.3羧甲基壳聚糖的免疫调节作用

第二章羧甲基壳聚糖的制备和性质研究

1材料及仪器

1.1材料及试剂

1.2主要仪器

2实验方法

2.1羧甲基壳聚糖的制备及纯化

2.2羧甲基壳聚糖羧化度的测定

2.3羧甲基壳聚糖灰分测定

2.4羧甲基壳聚糖的旋转黏度测定

2.5羧甲基壳聚糖水份测定

2.6羧甲基壳聚糖特性黏度的测定

2.7羧甲基壳聚糖分子量的测定

2.8羧甲基壳聚糖脱乙酰度的测定

2.9羧甲基壳聚糖的红外光谱表征

2.10羧甲基壳聚糖的热原检测

2.11羧甲基壳聚糖生物相容性研究

2.12统计学处理

3实验结果

3.1羧甲基壳聚糖的羧化度测定结果

3.2羧甲基壳聚糖物理性质测定结果

3.3羧甲基壳聚糖的红外光谱分析

3.4羧甲基壳聚糖除热原后内毒素检测结果

3.5羧甲基壳聚糖对L929细胞生长的影响

3.6羧甲基壳聚糖的组织相容性研究

4讨论

5本章小结

第三章交联型羧甲基壳聚糖的制备和性质研究

1材料及方法

1.1材料及试剂

1.2主要仪器

2实验方法

2.1交联型羧甲基壳聚糖交联条件的研究

2.2交联型羧甲基壳聚糖的制备

2.3交联型羧甲基壳聚糖的黏度测定

2.4交联型羧甲基壳聚糖的红外光谱表征

3实验结果

3.1交联剂的加入量对交联反应的影响

3.2温度对交联反应的影响

3.3pH对交联反应的影响

3.4交联时间对交联反应的影响

3.5 CM-CTS、C-CM-CTS和D-CM-CTS的黏度分析

3.6 CM-CTS、C-CM-CTS和D-CM-CTS的红外图谱分析

4讨论

4.1戊二醛交联的CM-CTS黏度的提高和水溶性

4.2硼氢化钠还原的作用

5本章小结

第四章交联型羧甲基壳聚糖的生物相容性研究

1材料及仪器

1.1材料及试剂

1.2溶液的配制

1.3主要仪器

2实验方法

2.1 L929细胞的培养

2.2 C-CM-CTS和D-CM-CTS对L929细胞生长的影响

2.3 C-CM-CTS和D-CM-CTS的组织相容性评价

2.4统计学处理

3实验结果

3.1 C-CM-CTS和D-CM-CTS对L929细胞生长的影响

3.2 C-CM-CTS和D-CM-CTS的组织相容性研究

4讨论

4.1交联型羧甲基壳聚糖对L929细胞生长的影响

4.2交联型羧甲基壳聚糖的生物相容性

5本章小结

第五章交联型羧甲基壳聚糖的免疫佐剂活性研究

1材料及仪器

1.1材料及试剂

1.2溶液的配制

1.3主要仪器

2实验方法

2.1溶血性实验[史宏灿，2002;Santos WR,1997]

2.2体外小鼠脾淋巴细胞增殖试验

2.3免疫程序

2.4体内小鼠脾淋巴细胞增殖试验

2.5血清中OVA特异性抗体效价测定

2.6统计学处理

3实验结果

3.1溶血性结果

3.2体外对小鼠脾淋巴细胞增殖反应的影响

3.3对OVA受免小鼠脾细胞增殖反应的影响

3.4对OVA受免小鼠血清中特异性抗体滴度水平的影响

4讨论

4.1淋巴细胞的体外增殖反应

4.2关于间接ELISA反应条件的选择

4.3免疫小鼠血清效价的变化规律

5本章小结

总结

参考文献

致谢