二十二碳六烯酸-磷脂生物活性的研究

摘要

二十二碳六烯酸(DocosahexaenoicAcid)-磷脂主要存在于乌贼的肌肉和卵中，是一种新型的天然产物。磷脂是动植物体内细胞膜的骨架成分，其双分子层结构维持着膜内外物质和信息的传递。DHA具有广泛的生理活性，如降血脂、预防动脉硬化、抑制肿瘤生长和免疫调节等作用。目前已证实，磷脂酰胆碱(Phosphatidylcholine PC)在Sn-2上位结合DHA后能够显示更好的生理活性。本文利用从鸢乌贼卵中提取制备的DHA-磷脂(其中PC含量为64.4％，脂肪酸组成中DHA占30％-40％)，探讨了DHA-PC的抗肿瘤活性及其作用机制；DHA-PC的免疫调节作用；DHA-PC对小鼠智力的影响以及对正常小鼠脂质代谢的调节作用。主要研究结果如下： 以肝癌细胞HepG-2为研究对象，研究了DHA-PC的体外抗肿瘤作用。采用MTT法证明了DHA-PC能够显著抑制HepG-2细胞的增殖(P<0.05，P<0.01)，具有显著的时效和量效关系；采用AO/EB染色法证明DHA-PC能够诱导细胞出现明显的凋亡形态；采用流式细胞术检测证明DHA-PC可以改变细胞的周期，使细胞停滞在G1/G0期。提示DHA-PC对肿瘤细胞的生长有明显的抑制作用，诱导细胞凋亡和细胞G1/G0期阻滞是其主要机制。采用细胞-基质粘附实验法、划痕实验法、Transwell小室重建基底膜侵袭实验、鸡胚尿囊膜实验以及Western-blotting法分别检测肿瘤细胞粘附、迁移、侵袭、血管新生以及肿瘤细胞VEGF的表达等能力，探讨了DHA-PC的体外抗肿瘤转移作用。结果表明：DHA-PC作用HepG-2细胞48h后，减弱了细胞与基质的粘附作用，其效应呈浓度依赖性(P<0.05，P<0.01)，显著抑制HepG-2细胞的迁移能力(P<0.05)，降低HepG-2细胞的侵袭能力(P<0.05，P<0.01)，显著抑制血管的新生，呈现浓度依赖效应，下调肿瘤细胞血管内皮细胞生长因子(Vascular EndothelialGrowth Factor，VEGF)的表达。提示DHA-PC能够抑制肿瘤细胞的转移，其作用机制可能与降低肿瘤细胞的粘附、迁移、侵袭能力、抑制肿瘤血管新生以及肿瘤细胞VEGF的表达有关。 利用S180建立移植性肿瘤小鼠模型，研究了DHA-PC的体内抗肿瘤作用。采用不同剂量(50、200mg/kg.bw)的DHA-PC灌胃荷瘤小鼠14d，结果表明：DHA-PC可明显抑制小鼠肿瘤的生长，其平均抑瘤率为38.06％，能够提高肿瘤小鼠血清和肝脏中抗氧化酶GST、GSH-PX(P<0.05，P<0.01)活力和GSH(P<0.05，P<0.01)的含量。肿瘤组织HE染色发现，DHA-PC组癌细胞出现明显褪变；免疫组化染色表明，DHA-PC组肿瘤血管密度显著低于模型组(P<0.05)。提示DHA-PC能够抑制小鼠体内肿瘤的生长，其作用机制与提高体内的抗氧化水平，降低肿瘤血管密度，抑制肿瘤血管的新生有关。 探讨了DHA-PC对荷瘤小鼠的免疫调节作用。结果表明：不同剂量(67、134和268mg/kg.bw)的DHA-PC能够提高小鼠脾指数(P<0.05)；显著提高荷瘤小鼠血清溶血素含量(P<0.01)；提高迟发型变态反应(P<0.05，P<0.01)；促进巨噬细胞的吞噬能力(P<0.01)。提示DHA-PC能全面调节机体的特异性和非特异性免疫功能。 利用腹腔注射东莨菪碱的方法建立实验性痴呆小鼠模型，灌胃不同剂量(50、100和200 mg/kg.bw)的DHA-PC，观察了其对小鼠智力发育的影响。结果表明：与模型对照组比较，DHA-PC能够显著降低大脑中MAO(P<0.01)、TChE(P<0.01)活力，提高SOD(P<0.05，P<0.01)活力，增加大脑组织中DHA的含量，降低n-6/n-3 PUFAs的比例。提示DHA-PC能够改善模型小鼠的智力。 研究了DHA-PC对正常小鼠脂质代谢的调节作用。利用试剂盒法分别检测了血清和肝脏中TC、TG含量，利用气相分析法检测了肝脏中主要脂肪酸的组成。结果表明：与正常对照组比较，DHA-PC可以显著降低小鼠血清和肝脏中的TC、TG含量(P<0.01)，提高肝脏组织中DHA含量(P<0.01)；与大豆磷脂对照组比较，可以显著降低小鼠血清中TC、TG含量(P<0.01)，肝脏中TC、TG含量(P<0.05，P<0.01)，提高肝脏组织中DHA含量(P<0.01)；与DHA对照组比较，DHA-PC能够提高血清中HDL-C含量(P<0.05)，显著降低肝脏中TG含量(P<0.05)。提示DHA-PC可以有效改善正常小鼠的脂质代谢水平，且作用效果要优于单独的DHA和PC。 本论文首次全面系统的研究了鸢乌贼卵中DHA-PC的生物活性，填补了国内空白。为水产品加工废弃物的高值化利用开辟了一个新的渠道，为其应用于保健品、医药等领域的研究奠定了实验基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：附表　英文缩略词

声明

前言

1磷脂概述

1.1磷脂的结构和理化性质

1.2磷脂的生物活性和功能

1.3磷脂的来源

2 DHA概述

2.1 DHA的结构和理化性质

2.2DHA的生物学特性

3 DHA—PC的概述

3.1癌症治疗作用

3.2调节脂质代谢

3.3增强学习记忆能力

3.4其它功能

4研究的目的及意义

第一章DHA—PC抗肿瘤活性的研究

第一节DHA—PC对HepG一2细胞增殖活性的影响

1实验材料与方法

2结果

3讨论

4小结

第二节DHA—PC对HEPG-2细胞体外抗肿瘤转移作用的研究

1实验材料与方法

2结果

3讨论

4小结

第三节DHA—PC对荷瘤小鼠肿瘤抑制作用的研究

1实验材料与方法

2实验结果

3讨论

4小结

第四节DHA—PC对荷瘤小鼠免疫调节作用研究

1实验材料与方法

2实验结果

3讨论

4小结

第二章DHA—PC对正常以及东莨菪碱所致痴呆小鼠智力的影响

第一节DHA—PC对正常小鼠智力影响的研究

1材料和方法

2结果

第二节DHA—PC对东莨菪碱所致痴呆小鼠智力的影响研究

1材料和方法

2结果

3讨论

4小结

第三章DHA—PC对正常小鼠脂质代谢的影响

1材料和方法

1.1材料

1.2方法

1.3统计学分析

2实验结果

2.1对小鼠体重以及进食量的影响

2.2对小鼠肝脏以及脂肪组织重量的影响

2.3对小鼠血清脂质水平的影响

2.4对小鼠肝脏脂质水平的影响

2.5对小鼠肝脏中脂肪酸组成的影响

3讨论

4小结

结论

本论文的特色及创新之处

参考文献

硕士期间发表论文情况

致谢