Tat蛋白上肝素新结合位点的确定及其功能研究

摘要

艾滋病是由人免疫缺陷病毒(HIV)引起的人体免疫系统衰退性恶性传染病，其流行形势仍然十分严峻。研究表明，Tat蛋白在艾滋病发生发展过程中具有重要作用。作为HIV的最主要的调节蛋白，Tat不但通过反式激活效应参与病毒基因的复制和表达，还可以分泌到胞外，抑制免疫细胞的分化和增殖，诱导其凋亡，激活静止的CD4+T细胞，利于HIV的感染和体内传播，同时还能使正常或变形的血管内皮细胞延伸、诱导血管生成或炎症发生，促进卡波氏肉瘤肿瘤细胞的发生、生长，直接或间接作用于皮质层和皮质下层区引起神经系统的损害，导致艾滋病痴呆，诱发肿瘤等。 肝素/硫酸乙酰肝素(heparin/HS)一直以来被认为是Tat蛋白发挥功能的分子伴侣。广泛存在各细胞膜表面的HSPG是Tat蛋白的受体，对Tat在细胞表面的富集、内化及随后HIV-LTR转录激活是必须的；反之，游离的heparin/HS可以竞争性结合胞外的Tat抑制其与细胞膜表面HSPG的结合。细胞外基质中的heparin/HS可以促进Tat蛋白在基质中积聚，增强内皮细胞的活化、生长、黏附和血管生成。长期以来Tat上的碱性氨基酸区被认为是唯一的肝素结合位点，但近期研究发现对碱性氨基酸富含区进行缺失或替换突变虽然影响结合但不足以阻断二者的相互作用，提示，除碱性氨基酸富含区外，Tat蛋白上还存在其它肝素结合位点。进一步确定Tat蛋白上其它Heparin结合位点，并探讨其在Tat功能中的作用，对阐明Tat-heparin相互作用的本质以及针对于Tat靶点的抗艾滋病药物的研制都具有重要意义。 本论文以计算机分子模拟为指引，借助分子生物学和生物芯片技术，首次发现了Tat蛋白上一个全新的由Lys12，Lys41，Arg78组成的空间三联体、高亲和力肝素结合位点(KKR区)，这是继Tat蛋白已知肝素结合位点(碱性氨基酸区)之后发现的另一全新位点。KKR区在序列上远离、但空间却毗邻相连。深入的生物学功能研究表明，KKR位点不影响Tat的内化过程，但可通过与细胞膜硫酸乙酰肝素结合，利于Tat介导的整合素活化，促进卡波氏肉瘤细胞的粘附能力。 1、Tat蛋白上Heparin新结合位点的发现及确证 (1)计算机模拟Tat上Heparin结合位点，预测了KKR区是heparin的新结合位点 在Tat蛋白NMR溶液构象基础上，我们建立了Tat蛋白同源模型作为分子模拟中的目标蛋白，以肝素2、4、6、8寡糖片段为探针进行了对接。结果发现，Tat蛋白上除了已知的肝素结合位点-序列线性相连的碱性氨基酸区外，还首次揭示了一个新的由Lys12，Lys41，Arg78构成的空间三联体位点(KKR区)，其在序列上远离、但空间却毗邻相连。 (2)Tat及其系列突变体蛋白的制备 在计算机模拟的指导下，设计了新位点的单点、双点、三点突变以及碱性氨基酸区与KKR区的共突变体，随后利用分子生物学技术，构建并表达纯化了相关蛋白，并采用质谱技术对主要蛋白进行了鉴定，证明各突变体蛋白突变成功，为Tat蛋白上肝素新结合位点的揭示奠定了物质基础。 (3)SPR技术确证了KKR区是Tat上Heparin的新结合位点 随后我们利用SPR技术观察了GST-Tat及其突变体与芯片Heparin的结合情况，对新位点进行了确证，并对其特性进行了考察。结果发现，GST-Tat蛋白与Heparin呈多相结合，表明Tat蛋白上存在多个Heparin结合位点，同时当碱性氨基酸区突变后(GST-Tat(G48-R57)A)，其与Heparin呈单相结合，可见除了已知的碱性氨基酸区外，Tat蛋白上尚存在另一个Heparin结合位点。对Lys12，Lys41，Arg78进行单一突变时(GST-TatK(12，41)A/R78A)，其与Heparin的结合能力显著下降，将其与碱性氨基酸区共同突变时(GST-Tatc(G48-R57)A/K(12，41)A/R7SA)，Tat蛋白与Heparin结合能力完全消除，表明Tat蛋白上确实存在除碱性氨基酸区之外的另一个Heparin结合位点(即由Lys12，Lys41，Arg78组成的KKR区)。在此基础上，我们进一步采用亲和力比较的策略，评价了KKR区中每个氨基酸残基在与Heparin相互作用中的贡献。研究发现，KKR区进行单点突变时，蛋白质与Heparin结合的亲和力均有部分降低；双点突变时，蛋白质与Heparin结合的亲和力呈明显降低；当Lys12，Lys41，Arg78三个氨基酸全部突变后，二者的亲和力则显著降低。上述研究表明Lys12，Lys41，Arg78三个氨基酸残基在KKR区与Heparin的结合中均发挥了重要的作用。 (4)KKR区为Heparin高亲和力特异性结合位点 亲和力的大小是结合模式中一个重要的评价指标，所以我们观察了新发现的KKR区与Heparin结合的亲和力，即单纯突变碱性氨基酸区后计算二者的亲和力，通过动力学的分析，表明KKR区以极高的亲和力与Heparin结合(5.31pM)，其大小约为碱性氨基酸区与Heparin结合亲和力的10000倍(32.6nM)，两个区域亲和力之间的悬殊差异使Heparin与Tat蛋白结合时优先占据碱性氨基酸区。竞争性抑制实验是研究分子间相互作用的经典实验，其结果显示Heparin对GST-Tat、GST-Tat(G48-R57)A与芯片Heparin结合的IC50值基本相同，而Heparin对GST-TatK(12，41)A/R78A与芯片Heparin结合的IC50值则有较大变化，基本达到其对GST-Tat半数抑制浓度的两倍，提示KKR区突变后对Tat蛋白与Heparin结合影响较为明显，也从另一个方面表明KKR区是Tat蛋白与Heparin的更高的亲和力位点。在计算机对接试验中也清晰的表明了这点，当探针为2糖片段时，其特异性识别KKR区，随着糖链的增长，它在占据KKR区的前提下逐渐向碱性氨基酸区延伸，当探针为4糖时，它到达Arg49；当为6糖时，探针接近了Arg52；当为8糖时，探针延伸到了Gln54。 分子间结合的特异性研究发现，HS能够竞争抑制KKR区(GST-Tat(G48-R57)A)与芯片Heparin的结合，而CSA、CSC、HA即使在浓度高达250μg/ml时则仅呈现较低的抑制作用，说明KKR区与Heparin/HS的结合具有一定的结构与位点特异性。 2、生物学功能研究发现，KKR位点不影响Tat的内化过程，但可通过与细胞膜硫酸乙酰肝素结合，利于Tat介导的整合素活化，促进卡波氏肉瘤细胞的粘附能力 (1)KKR区不影响Tat蛋白的内化功能 Tat蛋白内化是其发挥胞内功能的前提。我们首先观察了KKR区在Tat蛋白介导内化过程中的作用。结果表明，与碱性氨基酸区不同，KKR区不影响Tat蛋白的内化。 (2)KKR区通过与细胞膜HSPG结合，利于Tat介导的整合素活化，进而促进卡波氏肉瘤细胞的粘附 此外，Tat蛋白作为胞外基质，通过其RGD(78-80)区结合激活整合素家族，促进卡波氏肉瘤细胞的黏附，特别是基于KKR区恰有一位氨基酸落于RGD区，为此，我们进一步观察了KKR区对Tat介导的细胞黏附的影响。结果表明，KKR区突变后整合素的活化及其介导的黏附效应均有所降低；进一步利用竞争抑制试验考察Heparin结合特性在其中的贡献。研究发现，外加Heparin或使用特异性抗体封闭细胞表面HSPG后，KKR区促进的整合素活化及所介导的黏附效应均受到抑制，表明KKR区通过与细胞膜HSPG结合，介导Tat与整合素结合活化，进而促进卡波氏肉瘤细胞粘附。 综上所述，本论文综合利用计算机辅助技术、分子生物学技术和SPR技术，首次发现了Tat蛋白上一个全新的由Lys12，Lys41，Arg78组成的空间三联体、高亲和力肝素结合位点(KKR区)，这是继Tat蛋白已知肝素结合位点(碱性氨基酸区)之后发现的另一全新位点；不同于已知的碱性氨基酸区结合位点，KKR区在序列上远离、但空间却毗邻相连，是亲和力更高的肝素结合位点；进一步的功能研究表明KKR区不参与Tat的内化功能，但可通过与细胞膜硫酸乙酰肝素结合，利于Tat介导的整合素的活化，促进卡波氏肉瘤细胞的粘附能力。 本论文为阐明Tat-heparin相互作用的本质及其在艾滋病发病过程中的作用奠定了重要基础，同时也为靶向Tat蛋白的抗艾滋病药物的理性设计提供了重要的模板和理论依据。

目录

文摘

英文文摘

声明

0前言

第一部分Tat突变体蛋白原核表达载体的构建及蛋白的表达纯化和鉴定

0前言

1实验材料

1.1实验用菌种

1.2实验用质粒

1.3主要试剂与材料

1.4常用缓冲液及其它溶液的配制

1.5主要仪器

2实验方法

2.1 Tat上heparin结合位点的计算机模拟

2.2 Tat蛋白突变体的制备

2.3蛋白鉴定

3实验结果

3.1分子对接预测了Tat蛋白上肝素新结合位点

3.2 Tat蛋白突变体的制备

3.3蛋白鉴定

4讨论

5小结

第二部分 Tat蛋白上肝素结合位点的确定

0前言

1实验材料

1.1主要试剂与材料

1.2实验仪器

2实验方法

2.1 Heparin糖生物芯片的制备

2.2肝素及内源性糖胺聚糖类物质(GAGs)对GST-Tat及其突变体与芯片肝素结合的抑制作用

3实验结果

3.1 GST-Tat及其突变体与芯片肝素结合能力的比较

3.2 Heparin及其他内源性GAGs对GST-Tat及其突变体与芯片Heparin结合的抑制作用

4讨论

5小结

第三部分 KKKR区在Tat蛋白功能中作用的研究

0前言

1实验材料

1.1试剂与材料

1.2细胞和细胞培养

1.3主要仪器及数据处理软件

2实验方法

2.1内化试验

2.2黏附实验

2.3整合素活化试验

3结果

3.1 KKR区不影响Tat蛋白的内化功能

3.2KKR区通过与细胞膜HSPG结合，利于Tat介导的整合素活化，进而促进卡波氏肉瘤细胞的粘附

4讨论

5小结

结论与创新

一、结论

二、主要创新之处

参考文献

综述1：肝素/硫酸乙酰肝素结合蛋白研究方法进展

综述2：SPR技术在海洋糖生物学研究中的应用

致谢

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