球孢虫草(Cordyceps bassiana)生物学特性及活性成分研究

摘要

本文以球孢虫草为实验材料，利用菌种分离技术、PCR、高效液相色谱等技术和化学手段，对球孢虫草的生物学特性和化学成分进行了研究，主要包括以下内容：球孢虫草无型性确定和生活史验证，液体深层发酵条件及人工栽培条件优化，球孢虫草中蛋白质、氨基酸、甘露醇、多糖和核苷类物质的研究及多糖和小分子物质的活性测定。研究结果如下： 1.球孢虫草无型性确定和生活史验证：采用形态学鉴定和分子生物学鉴定相结合，确定了球孢虫草的无型性为球孢白僵菌。在此基础上对球孢白僵菌进行了生活史验证，从而有力的证明了球孢虫草与球孢白僵菌是同一物种的不同生长阶段，球孢虫草是有型性，而球孢白僵菌为无型性。 2.液体深层发酵条件及人工栽培条件优化：以EPS和菌丝体生物量为指标，由单因素实验和正交实验确定了该菌株液体发酵最佳培养基的组成为：蔗糖25‰、蛋白胨39‰，(NH4)2SO41.5‰、K2HPO41.5‰、MgSO40.5‰；由单因素实验确定了液体发酵条件为：初始pH7.0、温度26℃、装液量75mL/250mL、接种量5％、培养时间3d。在最佳的培养基和培养条件下，该菌株产EPS量高达1.8279/L，菌丝体生物量达2.1359/100mL。 以子实体质量和产量为指标，由单因素实验和正交实验，确定了人工栽培的最佳条件为：麦粒为原料，含水量70％，培养温度22～24℃，PH值7.0。 3.活性成分分析：研究发现，球孢虫草子座和菌丝体中蛋白质含量分别为：35.32％、24.05％，低于野生冬虫夏草，但氨基酸含量高于冬虫夏草，分别为25.96％、16.51％；球孢虫草菌丝体中甘露醇含量高达12.05％，高于子座和野生冬虫夏草。 采用GC和HPLC分别测定了球孢虫草多糖的单糖组成和核苷类物质的含量及组成，结果表明，球孢虫草胞外多糖(EPS)由甘露糖和半乳糖组成，摩尔比是1.2:1.0；胞内多糖(IPS)由甘露糖、半乳糖和葡萄糖组成，摩尔比为5.4:4.0:1.0。球孢虫草子座与发酵菌丝体中均含有鸟苷、腺苷和尿苷三种成分，且发酵菌丝体中三者的含量高于子座及野生冬虫夏草。通过五种活性成分测定，为综合评价球孢虫草内在品质和开发球孢虫草提供了科学依据。 4.活性测定：通过对多糖体外抗氧化活性研究发现：IPS具有清除DPPH·、·OH、·O2－和螯合Fe2+的作用，有强的还原力；EPS仅可以清除·OH，螯合Fe2+，对DPPH·和·O2－均没有清除作用，也没有还原力。IPS和EPS对革兰氏阳性菌的抑菌效果较好，对革兰氏阴性菌基本没有抑菌作用；乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物对选取的菌种均有较好的抑菌活性。

目录

文摘

英文文摘

声明

0前言

0.1虫草资源

0.2虫草的生物学特性

0.2.1虫草的形态和分布

0.2.2虫草生活史

0.2.3判定虫草无型性的方法

0.3虫草人工培养的研究进展

0.4虫草发酵研究进展

0.5虫草属真菌的化学成分

0.5.1虫草多糖类

0.5.2核苷类化合物

0.5.3蛋白质及氨基酸

0.5.4糖醇和甾醇类

0.5.5有机酸类

0.5.6 肽类

0.5.7维生素类

0.5.8无机盐

0.5.9其他类

0.6球孢虫草及僵蚕的研究进展

0.6.1球孢虫草及僵蚕的关系

0.6.2僵蚕在传统医学上的应用

0.6.3僵蚕现代的研究进展

0.7立题背景及意义

1球孢虫草菌株的筛选及人工栽培条件研究

引言

1.1材料与方法

1.1.1菌种

1.1.2主要试剂

1.1.3主要仪器

1.1.4培养基

1.1.5菌株的分离纯化

1.1.6发酵液的制备

1.1.7优良菌株的筛选

1.2球孢虫草人工栽培条件研究

1.2.1原料

1.2.2原料含水量

1.2.3 PH值

1.2.4温度

1.2.5通气处理

1.2.6栽培条件的正交实验

1.3结果与分析

1.3.1菌株筛选结果

1.3.2栽培原料对球孢虫草子实体生长的影响

1.3.3原料含水量对球孢虫草子实体生长的影响

1.3.4温度对球孢虫草子实体生长的影响

1.3.5 PH值对球孢虫草子实体生长的影响

1.3.6通气处理对球孢虫草子实体生长的影响

1.3.7正交实验

1.4讨论与小结

2 C.BassianaJY003菌株鉴定及生活史验证

引言

2.1材料与方法

2.1.1菌株

2.1.2主要仪器

2.1.3溶液的配制

2.2实验方法

2.2.1 形态学鉴定

2.2.2 PCR鉴定

2.2.2 球孢虫草生活史验证

2.3结果与分析

2.3.1 C.BassianaJY003形态学鉴定结果

2.3.2 C.BassianaJY003PCR鉴定结果

2.3.3 C.BassianaJY003生活史验证

2.4讨论与小结

3 Beauveria bassiana液体培养条件的优化

引言

3.1材料与方法

3.1.1主要试剂

3.1.2主要仪器

3.1.3培养基

3.1.4发酵条件的研究

3.1.5多糖的测定：苯酚—硫酸法

3.1.6菌丝体生物量的测定（以干重计）

3.1.7残糖含量测定

3.2结果分析

3.2.1标准曲线

3.2.2发酵培养基的确定

3.2.3发酵条件的确定

3.3本章小结

4球孢虫草化学成分的测定

引言

4.1蛋白质含量的测定

4.1.1材料与方法

4.1.2结果分析

4.2氨基酸含量的测定

4.2.1材料与方法

4.2.2结果与分析

4.3甘露醇的提取与测定

4.3.1材料与方法

4.3.2实验结果

4.4糖的制备与分析

4.4.1材料与方法

4.4.2结果分析

4.5核苷类化合物的测定

4.5.1材料与方法

4.5.2结果与分析

4.5.3讨论

4.5.4本章小结

5生物活性测定

引言

5.1多糖的体外抗氧化活性

5.1.1材料与方法

5.2多糖及小分子物质抑菌活性

5.2.1材料与方法

5.3结果与分析

5.3.1多糖对DPPH自由基的清除作用

5.3.2多糖对·OH的清除作用

5.3.3多糖对·O2-的清除作用

5.3.4多糖的总还原力

5.3.5多糖对Fe2+的螯合作用

5.3.6抑菌谱实验

5.4本章小结

结语

附图

参考文献

致谢

个人简历及硕士期间发表的论文情况