大黄鱼(Pseudosciaena crocea)三种组织细胞系的建立、鉴定及其应用的初步研究

摘要

近年来,随着海洋环境污染的日益加剧,各种病毒性和细菌性疾病的大规模爆发,以及鱼类种质严重退化,给海水鱼类养殖业造成了巨大的经济损失。利用鱼类细胞系,选择多种合适的生物检测标记对海洋中各种环境污染物进行快速灵敏的检测,并且建立快速灵敏有效的生物检测体系,是当前环境污染物检测及环境毒理学研究的重点。同时利用鱼类细胞系进行鱼类免疫基因及免疫机理的相关研究,弄清鱼类免疫机制,对从根本上预防和治疗鱼类疾病有重要理论意义和实际应用价值。另外,利用鱼类细胞系进行外源基因的转染,在研究基因表达调控、突变分析、蛋白纯化表达等分子生物学和细胞工程等领域具有重大的应用价值,而且为转基因抗病抗逆新品种的培育奠定基础。
　　 大黄鱼(Pseudosciaena crocea)属于硬骨鱼纲、鲈形目、石首鱼科、黄鱼属,肉质鲜美,营养丰富,曾是我国著名的四大海洋捕捞对象之一,现在是我国最主要的海水养殖鱼类之一,也面临环境污染、病害入侵及种质退化的严重影响,急需建立其组织细胞系,开展环境污染检测、鱼类免疫机理及转基因技术研究,但遗憾的是,至今仍未有成功建立大黄鱼组织细胞系的相关报道。
　　 为了建立大黄鱼鳍、吻端和脾脏组织的连续性细胞系,本文采用酶消化的组织块启动了鳍和吻端组织细胞的原代培养,非酶消化的组织块法启动了脾脏组织细胞的原代培养。对三种组织细胞的最适培养基和最适培养温度的研究结果显示,其最适培养基均为添加了100μg/mL羧甲基壳寡糖、40μg/mL硫酸软骨素、10ng/mL碱性成纤维样生长因子和40ng/mL型胰岛素样生长因子的20％胎牛血清(FBS)-Dulbecco's Modified Eagle Medilμm:Ham's Nutrient F-12(DMEM/F12,1:1)(pH7.2)、最适培养温度均为25℃;在该最适培养体系中,三种组织细胞生长分裂旺盛,均为成纤维细胞样形态,鳍、吻端和脾脏细胞分别于20天、22天和21天长成汇合单层;经连续继代培养后,鳍细胞现已传至第100代,吻端细胞现已传至第80代,脾脏细胞现已传至第70代,已成功建立了大黄鱼鳍、吻端和脾脏细胞三种连续性细胞系。染色体数目与核型分析显示第60代大黄鱼鳍、吻端和脾脏细胞的特征染色体数目仍为48条,确定其为大黄鱼细胞。第60代大黄鱼鳍、吻端和脾脏细胞生长特性分析显示三种细胞的群体倍增时间分别为50.96h,51h和48.7h。
　　 本文利用大黄鱼鳍细胞系对久效磷进行了快速灵敏的检测,并初步研究了久效磷对鳍细胞的毒性作用和致毒机理。本文使用不同浓度久效磷处理大黄鱼鳍细胞系细胞,发现5μg/mL久效磷即可对鳍细胞产生细胞毒性,且随着久效磷浓度的增加,对细胞的毒性作用逐渐增大。利用MTT法和细胞蛋白含量测定法所得的久效磷对鳍细胞的48h细胞半数抑制浓度(48h-IC50)分别为43.05和46.24μg/mL。在细胞形态结构方面,久效磷处理鳍细胞72h后,细胞开始出现变圆脱落现象并随后大量死亡。细胞生物标志酶活性变化结果显示,久效磷可引起鳍细胞乙酰胆碱酯酶(AChE)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽-S-转移酶(GST)活性的显著变化。由以上结果可知大黄鱼鳍细胞系细胞对久效磷的敏感性较高,检测其毒性所需时间短,鳍细胞的AChE、SOD和GST三种酶活性可作为久效磷的生物检测标记。
　　 本文利用大黄鱼吻端细胞系进行了Toll样受体2(Toll-like receptor2,TLR2)基因片段克隆及其免疫功能的相关研究。采用Trizol法从大黄鱼吻端细胞提取总RNA,通过RT-PCR的方法克隆到242bp的cDNA保守序列,并且通过RACE的方法得到469bp的3’末端cDNA序列,通过核酸序列比对和氨基酸序列比对确定得到的cDNA片段为大黄鱼TLR2cDNA片段,并且发现此氨基酸序列位于TLR2胞内TIR保守区内,属于TIR超家族成员。根据获得的TLR2 cDNA序列设计荧光定量PCR引物,通过荧光定量PCR分析大黄鱼吻端细胞TLR2 mRNA相对表达量的变化,结果显示用灭活的枯草杆菌、哈维式弧菌和出芽酵母菌处理细胞24h后TLR2 mRNA表达量显著增加,分别增加了4.74倍,3倍和2.57倍。由以上结果可知TLR2模式识别受体不但识别革兰氏阳性细菌,而且识别革兰氏阴性细菌和真菌,从而参与大黄鱼吻端细胞对细菌和真菌的免疫反应。
　　 本文利用大黄鱼脾脏细胞系对GFP报告基因进行了转染,结果显示有GFP报告基因的阳性表达。并且对转染条件进行了优化,发现细胞培养24h后,细胞融合度达到90％时,DNA与LipofectamineTM2000的比例为1/4时,脾脏细胞系细胞的转染效率最高,约为10％。因此,此细胞系可以作为外源基因转染的研究体系,为进行转基因鱼新品种的培育奠定了基础。
　　 本文成功建立了大黄鱼三种连续性组织细胞系,并利用这三种细胞系作为体外研究体系,分别在环境污染物的细胞毒性检测、Toll样受体2基因表达及功能分析以及转基因技术方面进行了研究,为大黄鱼组织细胞系在环境污染物检测、鱼类免疫机理以及转基因鱼新品种培育研究方面奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

第一章 文献综述

1 重要海水养殖鱼类概述

1.1 重要海水经济鱼类的养殖现状

1.2 重要海水经济鱼类养殖业存在的主要问题

2 鱼类细胞系的建系意义及其理论与应用价值

2.1 鱼类细胞系在环境污染物检测中的应用

2.2 鱼类细胞系在鱼类免疫学中的应用

2.3 鱼类细胞系在转基因技术研究中的应用

2.4 鱼类细胞系在其它研究中的应用

3 鱼类细胞培养与细胞系建立的研究进展

3.1 鱼类细胞培养的基本方法

3.2 目前国内外已建立的鱼类细胞系

4 本论文的研究目的和研究意义

第二章 大黄鱼三种组织细胞系的建立及其鉴定

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.2 实验试剂及溶液配制方法

1.3 主要实验仪器

1.4 大黄鱼鳍、吻端和脾脏组织细胞原代培养的启动

1.5 大黄鱼鳍、吻端和脾脏组织细胞最适培养基的确定

1.6 大黄鱼鳍、吻端和脾脏组织细胞最适培养温度的确定

1.7 大黄鱼鳍、吻端和脾脏组织细胞的传代培养

1.8 大黄鱼鳍、吻端和脾脏细胞系细胞的冻存与复苏

1.9 大黄鱼鳍、吻端和脾脏细胞系细胞的生长曲线测定

1.10 大黄鱼鳍、吻端和脾脏细胞系细胞的染色体分析

2 结果

2.1 大黄鱼鳍、吻端和脾脏组织细胞的最适培养基

2.2 大黄鱼鳍、吻端和脾脏组织细胞最佳培养温度

2.3 大黄鱼鳍、吻端和脾脏组织细胞的传代培养及其细胞系的建立

2.4 大黄鱼鳍、吻端和脾脏细胞系细胞的生长特性

2.5 大黄鱼鳍、吻端和脾脏细胞系细胞的冻存与复苏

2.6 大黄鱼鳍、吻端和脾脏细胞系细胞的染色体分析

3 讨论

3.1 大黄鱼三种细胞系细胞的原代启动方法

3.2 大黄鱼三种细胞系细胞的最适体外培养体系

3.3 大黄鱼三种细胞系细胞的传代方法及其生长特性

3.4 大黄鱼三种细胞系细胞的染色体分析

4 本章小结

第三章 大黄鱼鳍细胞系在有机磷农药毒性研究及其环境污染检测中的应用

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.2 实验试剂及溶液配制方法

1.3 主要实验仪器

1.4 不同浓度久效磷对大黄鱼鳍细胞系细胞的处理

1.5 MTT法检测久效磷对大黄鱼鳍细胞系细胞的毒性作用

1.6 细胞总蛋白含量法检测久效磷对大黄鱼鳍细胞系细胞的毒性作用

1.7 久效磷对大黄鱼鳍细胞系细胞乙酰胆碱酯酶活性的影响

1.8 久效磷对大黄鱼鳍细胞系细胞超氧化物歧化酶活性的影响

1.9 久效磷对大黄鱼鳍细胞系细胞谷胱甘肽-S-转移酶活性的影响

1.10 统计分析

2 结果

2.1 久效磷对大黄鱼鳍细胞系细胞的48h半数抑制浓度

2.2 久效磷处理的大黄鱼鳍细胞系细胞在光镜下的形态变化

2.3 久效磷对大黄鱼鳍细胞系细胞乙酰胆碱酯酶活性的影响

2.4 久效磷对大黄鱼鳍细胞系细胞超氧化物歧化酶活性的影响

2.5 久效磷对大黄鱼鳍细胞系细胞谷胱甘肽-S-转移酶活性的影响

3 讨论

3.1 久效磷对大黄鱼鳍细胞系细胞的毒性效应

3.2 久效磷对大黄鱼鳍细胞系细胞三种生物标志酶活性的影响及其致毒机理探讨

3.3 应用大黄鱼鳍细胞系检测水环境中久效磷污染的可行性

4 本章小结

第四章 Toll样受体2基因在大黄鱼吻端细胞系中的表达及其免疫功能研究

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.2 实验试剂及溶液配制方法

1.3 主要实验仪器

1.4 大黄鱼吻端细胞系细胞总RNA的提取

1.5 TLR2 cDNA第一条链的合成

1.6 TLR2 cDNA保守序列的PCR扩增

1.7 TLR2凝胶电泳DNA片段的回收

1.8 DNA片段与克隆载体pMD18-T的连接

1.9 大肠杆菌感受态细胞的制备

1.10 质粒向大肠杆菌转化(热激法)

1.11 PCR快速鉴定阳性克隆

1.12 核酸序列测定及分析

1.13 3’RACE扩增TLR2 3’末端序列

1.14 实时定量PCR分析TLR2 mRNA表达量变化

2 结果

2.1 大黄鱼吻端细胞系细胞总RNA的提取与鉴定

2.2 大黄鱼TLR2保守区cDNA的克隆

2.3 3’RACE扩增TLR2 3’末端序列

2.4 实时定量PCR分析TLR2 mRNA表达量变化

3 讨论

3.1 大黄鱼吻端细胞系细胞总RNA的提取与鉴定

3.2 大黄鱼TLR2 cDNA片段扩增

3.3 实时定量PCR分析TLR2 mRNA表达量变化

4 本章小结

第五章 大黄鱼脾脏细胞系转基因技术的初步研究

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.2 实验试剂及溶液配制方法

1.3 主要实验仪器

1.4 G418的最佳筛选浓度

1.5 pcDNA3.1-GFP质粒的提取

1.6 脂质体Lipofectamine2000TM介导大黄鱼脾脏细胞系细胞转染

1.7 最适细胞融合度的确定

1.8 最适DNA与脂质体比例的确定

1.9 数据处理

2 结果

2.1 G418的最佳筛选浓度

2.2 质粒提取

2.3 GFP报告基因在大黄鱼脾脏细胞系细胞中的表达

2.4 最适细胞融合度的确定

2.5 最适DNA与脂质体比例的确定

3 讨论

4 本章小结

全文总结

本文主要创新点

参考文献

致谢

在学期间发表的学术论文及专利