文昌鱼类脊椎动物甲状腺-肝轴的证明

摘要

文昌鱼(Amphioxus)是介于无脊椎动物和脊椎动物之间的过渡类型,是现存的与脊椎动物祖先最接近的无脊椎动物,一直被认为是研究脊椎动物起源和进化的重要模式动物。甲状腺-肝脏轴在包括七腮鳗在内的脊椎动物中普遍存在,然而其起源还是一个谜。在文昌鱼中有一个与甲状腺同源的器官--内柱,有一个肝脏同源的器官--肝盲囊,暗示文昌鱼中可能存在类甲状腺-肝脏轴,但是,尚没有证据证明文昌鱼内柱(类甲状腺)和肝盲囊(类肝脏)之间存在功能上的联系。本论文的主要部分就是论证文昌鱼中存在类脊椎动物甲状腺.肝脏轴信号通路。
　　 本论文首先从文昌鱼中克隆到一个肝富集转录因子CAAT区/增强子结合蛋白BbC/EBPα/β的开放阅读框,可编码-80个氨基酸的蛋白质序列,分子量为9.3kDa。该蛋白序列同其它物种C/EBPα和C/EBPβ氨基酸序列进行比对分析,BbC/EBPα/β氨基酸序列与C/EBPα的相似性为51.9-54.4％,与C/EBPp的相似性为51.9-59.7％。这说明BbC/EBPα/β与C/EBPα和C/EBPβ具有相同的相似性,因而本论文将其命名为BbC/EBPα/β。它与从弗罗里达文昌鱼基因组文库中分析出来的C/EBP的相似性达到94.3％。本论文推测BbC/EBPα/β可能是脊椎动物C/EBPα和C/EBPβ的原型。这个结论为构建的系统进化树进一步证实。构建的进化树表明BbC/EBPα/β蛋白位于脊椎动物C/EBPα和C/EBPβ分枝的基部,而C/EBPα和C/EBPβ各自聚群。组织特异性分析表明,BbC/EBPα/β同脊椎动物的C/EBPa和C/EBPβ-样,主要在肝盲囊表达。本论文又克隆了文昌鱼的甲状腺激素受体BbTR基因的完整开放阅读框,可编码-430个氨基酸的蛋白质序列,其分子量为49 kDa。BbTR基因推导的氨基酸序列与已报道的弗罗里达文昌鱼的TR相似性高达94.3％,且主要活性位点保守。组织特异性分析表明,BbTR在包括肝盲囊在内的全身各处都有表达。原位杂交结果表明,BbTR在内柱中的表达主要集中在碘结合区(5区和6区),佐证了内柱与甲状腺的同源。实时定量PCR结果表明,不管是在体内还是体外实验中,甲状腺激素(T4)、三碘甲腺原氨酸(T3)和它们的衍生物三碘甲腺乙酸(TRIAC)均能刺激BbC/EBPα/β在肝盲囊中的表达,但是T4的作用相对要弱一些。而且,T4的作用可以被脱碘抑制剂碘泛酸抑制,说明T4要在体内脱碘转换成T3才能发挥作用。荧光猝灭实验表明T3和TRIAC都能和重组表达的BbTR结合,而T4不能结合。另外,本论文检测到内柱中富含T3和T4,同脊椎动物的甲状腺一样。结果说明,在文昌鱼中可以通过T3/TRIAC-TR的方式诱导BbC/EBPα/β表达。也就是说,文昌鱼中可能存在类脊椎动物甲状腺-肝脏轴的信号通路。
　　 本文第二部分是重组表达斑马鱼卵黄蛋白原(Vg)的卵黄高磷蛋白(Pv)部分,并对其抑菌活性进行研究,推测其在胚胎发育中的功能。
　　 首先,本论文重组表达了斑马鱼的Pv,并进行了质谱鉴定。然后,本论文检测了Pv的抑菌活性,发现Pv对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都有很强的抑制作用,电镜扫描结果发现菌体表面受到破坏。将异硫氰酸荧光素(FITC)标记的重组Pv各种菌孵育后荧光显微镜观察发现重组Pv可以分别与E.coli和S.aureus结合;另外通过酶联免疫吸附实验(ELISA)证明重组Pv可以与病原相关模式分子(PAMPs)脂多糖(LPS)、脂磷壁酸(LTA)、肽聚糖(PGN)发生特异性结合,并且结合呈现浓度依赖性。结果表明Pv是一种多价的模式识别受体。铁结合实验表明重组Pv不能与铁结合,添加铁离子也不能减弱重组Pv的抑菌活性。这表明重组Pv的抑菌活性与夺铁机制无关。ELISA实验检测Pv在胚胎发育不同时期的含量结果显示,在胚胎发育初期,含有较高的Pv浓度,随着发育时间的延长,Pv含量逐渐减少,但直到12小时胚胎内Pv浓度仍维持在可以显著抑菌水平之上。这些结果说明在发育早期,Pv起着营养作用以外的免疫防御功能。为寻找Pv的抑菌活性中心,本论文先采用氨基端切除的方法,发现直到切除了氨基端194个氨基酸残基,剩下的55个氨基酸残基仍有抑菌活性。在此基础上,采用定点突变的方法,继续寻找抑菌活性中心。结果显示,带正电荷和疏水的氨基酸残基对Pv的抑菌活性起到关键的作用。总而言之,Pv在斑马鱼胚胎发育过程中起着免疫防御的功能,而不仅仅是营养物质。Pv的抑菌活性中心在羰基端,带正电荷和疏水的氨基酸残基对于抑菌活性比较关键。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:缩略词表

第一章 文献综述

1.文昌鱼及其形体结构

2.甲状腺激素(THs)和甲状腺激素受体(TR)

3.甲状腺与肝脏疾病的关系以及甲状腺-肝轴的研究进展

4.CAAT区/增强子结合蛋白(C/EBP)的研究进展

5.卵黄蛋白原(Vg)和卵黄高磷蛋白(Pv)的研究概况

6.蛋白抑菌机制的研究情况

7.本文的研究目的及技术路线

第二章 文昌鱼类脊椎动物甲状腺-肝脏轴的证明

1 前言

2 材料和方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

3 结果

3.1 文昌鱼总RNA的提取及cDNA的获得

3.2 BbC/EBPα/β基因和BbTR基因ORF的扩增

3.3 获得的BbC/EBPα/β基因和BbTR基因的序列分析

3.4 BbC/EBPα/β和BbTR在不同组织的表达情况

3.5 切片原位杂交分析BbTR基因在成体文昌鱼内柱中的表达区域

3.6 BbC/EBP α/β受T3、T4和TRIAC作用的在肝盲囊中的表达

3.7 重组BbLBD(TR的配体结合域)的表达和纯化

3.8 T3、T4和TRIAC与重组BbLBD结合系数的测定

3.9 文昌鱼内柱中T3和T4含量的测定

4 讨论

第三章 斑马鱼卵黄高磷蛋白免疫作用研究

1.前言

2.材料和方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

3 结果

3.1 确认卵黄高磷蛋白的核苷酸序列

3.2 卵黄高磷蛋白(Pv)部分核酸序列的扩增

3.3 重组表达载体的构建及诱导表达

3.4 重组His-Pv融合蛋白的纯化与鉴定

3.5 重组His-Pv蛋白的溶菌活性

3.6 FITC-labeled His-Pv与各种菌的结合

3.7 重组His-Pv蛋白与病原相关模式分子的结合

3.8 重组蛋白His-Pv螯合铁离子的活性鉴定及铁对重组蛋白抑菌活性的影响

3.9 N端切除法寻找His-Pv的抑菌活性中心

3.10 点突变对His-Pv抑菌活性的影响

3.11 突变His-Pv蛋白与病原相关模式分子的结合

3.12 斑马鱼卵中存在Pv且含量随发育时期变化

3.13 免疫共沉淀后胚胎匀浆液抑菌活性变化

4.讨论

结论

参考文献

致谢

作者简历

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