唾液酸转移酶ST8Sia VI在乳腺癌细胞转移过程中的作用及其分子机制的初步研究

摘要

肿瘤的发生、发展以及转移与糖链的表达密切相关,肿瘤细胞表面唾液酸化糖链的结构和数量的变化会引起肿瘤细胞运动黏附、迁移侵袭、增殖凋亡等多种功能的改变。唾液酸化的糖链是由一种或多种唾液酸转移酶催化合成的,α2,8-唾液酸转移酶Ⅵ(ST8SSia Ⅵ)是鼠的唾液酸转移酶家族20个成员之一,是第一个被报道的催化O-聚糖唾液酸化的α2,8-唾液酸转移酶。ST8Sia Ⅵ对糖蛋白和糖鞘脂的糖基非还原末端的NeuAcα2,3(6)Gal序列有催化活性,该酶催化底物形成NeuAcα2,8NeuAc的二聚唾液酸化结构。2005年人的STSSia Ⅵ糖基转移酶也被克隆出来,但是关于STSSia Ⅵ功能的研究很少,其在细胞的生理和病理过程中的作用国内外均无相关报道。本文旨在研究STSSia Ⅵ在乳腺癌细胞转移过程中的作用,并探讨其作用机制,为阐明细胞膜上糖蛋白的二聚唾液酸化在肿瘤的发生和发展过程中的重要作用提供理论依据,同时为肿瘤的诊断和治疗开辟新途径。
　　 本实验以小鼠乳腺癌细胞4T1和67NR为研究对象。首先,构建了稳定的ST8Sia Ⅵ过表达的4T1和67NR细胞株,在体外探讨了ST8Sia Ⅵ对肿瘤细胞行为学方面的影响。MTT法实验表明,STSSia Ⅵ对4T1和67NR细胞的生长无影响;Transwell小室实验证明STSSia Ⅵ明显促进4T1和67NR细胞的迁移能力。这些实验结果表明STSSia Ⅵ的过表达能够提高小鼠乳腺癌细胞的恶性程度,对于4T1细胞尤其作用尤其显著。实验结果证实ST8Sia Ⅵ在乳腺癌细胞转移过程中发挥重要作用。
　　 在4T1细胞中寻找STSSia Ⅵ促进乳腺癌细胞转移相关靶蛋白或信号通路,发现ST8Sia Ⅵ过表达对MAPK通路的激活尤为显著。实验发现细胞因子IL-6可以部分通过gp130-JAK通路来激活MAPK通路,但是gp130受体和IL-6R受体不是ST8Sia Ⅵ的靶蛋白。实验发现发现MAPK通路在ST8Sia Ⅵ促进乳腺癌细胞转移中起关键作用,当抑制MAPK的活性后,ST8Sia Ⅵ增强乳腺癌细胞迁移能的作用消失,表明4T1中ST8Sia Ⅵ是通过MAPK信号通路依赖的机制来影响细胞的迁移能力,其中ST8Sia Ⅵ的糖基化修饰靶蛋白需要进一步研究。
　　 综上所述,唾液酸转移酶ST8Sia Ⅵ能够促进小鼠乳腺癌细胞的迁移能力,初步实验结果表明,ST8Sia Ⅵ主要通过激活MAPK信号通路促进乳腺癌4T1细胞转移,IL-6和gp130信号通路在其中起到重要作用,但不是ST8Sia Ⅵ的修饰靶蛋白,靶蛋白有待进一步研究。本研究为进一步研究唾液酸转移酶在肿瘤的发生和发展过程中的作用提供了理论基础。

目录

文摘

英文文摘

前言

1 糖生物学

1.1 糖链介导细胞识别与粘附

1.2 糖链与信号转导

1.3 糖链与肿瘤转移

2 糖基转移酶

2.1 糖基转移酶的结构和功能

2.2 糖基转移酶的反应

3 唾液酸与唾液酸转移酶

3.1 唾液酸

3.2 唾液酸转移酶

3.3 唾液酸化的糖链及相应的唾液酸转移酶与肿瘤

3.4 多聚唾液酸与肿瘤

4 α2,8-唾液酸转移酶Ⅵ(ST8Sia Ⅵ)的研究进展

4.1α2,8-唾液酸转移酶家族

4.2 α2,8-唾液酸转移酶Ⅰ(ST8Sia Ⅰ)

4.3 α2,8-唾液酸转移Ⅲ(ST8Sia Ⅲ)

4.4 α2,8-唾液酸转移酶Ⅱ和Ⅳ(ST8Sia Ⅱ和Ⅳ)

4.5 α2,8-唾液酸转移酶Ⅴ(ST8Sia Ⅴ)

4.6 α2,8-唾液酸转移酶Ⅵ(ST8Sia Ⅵ)

5 本论文的研究目的和技术路线

第一章 ST8Sia Ⅵ表达载体的构建

1 材料

1.1 菌种和载体

1.2 试剂

1.3 仪器

1.4 主要试剂的配制

2 LZRS-ST8Sia Ⅵ质粒的构建

2.1 采用碱裂解法提取LZRS-MS-neo质粒和pRc/CMV-ST8Sia Ⅵ质粒

2.2 以pRc/CMV-ST8Sia Ⅵ质粒为模板PCR扩增ST8Sia Ⅵ目的片段

2.3 目的片段的胶回收

2.4 ST8Sia Ⅵ目的片段与pMD18-T载体连接

2.5 感受态细胞的制备[84]

2.6 转化

2.7 阳性克隆的筛选鉴定

2.8 质粒PCR鉴定

2.9 质粒双酶切鉴定

2.10 单酶切LZRS-MS-neo质粒

2.11 DNA片段的末端平滑化

2.12 单酶切LZRS-MS-neo质粒

2.13 片段与LZRS-MS-neo载体连接

2.14 阳性克隆的筛选鉴定

2.15 质粒双酶切鉴定

3 结果

3.1 pMD18-T-ST8Sia Ⅵ载体的构建

3.2 质粒LZRS-ST8Sia Ⅵ的构建

4 小结

5 讨论

5.1 逆转录病毒载体的特点

5.2 逆转录病毒载体的应用

5.3 平滑末端DNA片段与载体的连接

第二章 小鼠肿瘤细胞ST8Sia Ⅵ过表达细胞株的构建

1 材料

1.1 细胞株

1.2 菌种和载体

1.3 试剂

1.4 仪器

1.5 主要试剂的配制

2 方法

2.1 细胞转染和阳性克隆筛选

2.2 STSSia Ⅵ mRNA表达的检测

3 结果

3.1 细胞ST8Sia Ⅵ mRNA的表达

3.2 细胞ST8Sia Ⅵ蛋白水平的表达

3.3 ST8Sia Ⅵ对细胞膜表面糖链的修饰

4 小结

5 讨论

5.1 影响转染效率的主要因素

5.2 逆转录病毒LZRS-MS-neo的特点

第三章 ST8Sia Ⅵ对小鼠乳腺癌细胞行为学的影响

1 材料

1.1 试剂

1.2 仪器

2 方法

2.1 细胞及细胞复苏

2.2 细胞培养及传代

2.3 MTT法检测细胞增殖活性

2.4 细胞迁移能力的检测[86]

2.5 统计学分析

3 结果

3.1 细胞体外增殖的变化

3.2 细胞体外迁移能力的变化

4 小结

5 讨论

5.1 ST8Sia Ⅵ与肿瘤转移关系的体外研究

5.2 二聚唾液酸结构的生物学意义

第四章 MAPK信号通路在ST8Sia Ⅵ介导的小鼠乳腺癌迁移过程中的作用

1 实验材料

1.1 细胞株

1.2 主要试剂

1.3 主要仪器

2 实验方法

2.1 MAPK活性(磷酸化)的检测

2.2 IL-6刺激实验

2.3 gp130和IL-6R免疫共沉淀实验

2.4 AG490对MAPK活性抑制实验

2.5 PD98059对MAPK活性抑制实验

2.6 Transwell检测MAPK通路在细胞迁移过程中的作用

3 实验结果

3.1 ST8Sia Ⅵ对MAPK信号的调节作用

3.2 梯度实验

3.3 gp130和IL-6R受体的糖基化检测

3.4 Transwell检测MAPK通路在ST8Sia Ⅵ介导的乳腺癌细胞迁移过程中的作用

4 小结

5 讨论

5.1 IL-6的多重生物学功能

5.2 MAPK通路与gp130通路的相互作用

5.3 唾液酸糖基化的检测

总结和展望

本研究论文的创新点

参考文献

致谢

个人简历

发表的学术论文