扇贝养殖海区浮游生物和大型海藻携带AVNV的检测及浮游生物多样性分析

摘要

栉孔扇贝在我国海水养殖业中占有重要地位，给我国北方沿海地区带来巨大的经济效益。但自20世纪90年代以来栉孔扇贝大规模死亡在我国北方养殖海区连年暴发，造成了不可挽回的严重经济损失。已有的研究表明，AVNV是导致栉孔扇贝在养殖中后期大量死亡的直接病原，但是有关该病原流行传播方式仍不清楚。为了研究浮游生物携带AVNV的可能性，本论文采用FQ-PCR检测技术，从2008年至2009年对青岛沙子口和荣成桑沟湾2个扇贝养殖海区多个月份浮游生物及大型海藻携带AVNV的情况进行了定量检测，目的在于弄清浮游生物和大型海藻携带AVNV的情况及其季节性变化，以期为认识AVNV的传播和制定预防控制措施提供理论依据。
　　 本研究从2009年5月至11月，分别从青岛沙子口和荣成桑沟湾两个扇贝养殖海区定期采取50cm和300cm两个水层水样，经25μm、3μm、0.22μm三个孔径的滤膜分级过滤收集三个不同粒径的浮游生物，利用荧光定量PCR技术对浮游生物携带AVNV的情况进行了定量检测。结果表明两个海区浮游生物样品均检测到AVNV，检测的AVNV数量也均在8月份达到峰值，沙子口海区每升海水中浮游生物携带4.11×106拷贝的AVNV，桑沟湾海区浮游生物携带1.49×105拷贝的AVNV。3个粒径浮游生物组分携带AVNV的数量从低到高依次为0.22μm-3μm粒径组分、3μm-25μm粒径组分和大于25μm粒径组分。但2个水层(50cm和300cm)浮游生物携带AVNV的数量则没有显著差异。这一结果说明养殖海区浮游生物可以携带AVNV，携带AVNV的数量存在显著的季节性差异，不同大小的浮游生物携带AVNV的数量也显著不同。结合扇贝摄食浮游生物的特点，本研究结果表明，扇贝在养殖期间通过滤食携带病毒的浮游饵料而感染AVNV是可能的，海区浮游生物可能是导致AVNV流行的重要传播媒介。
　　 2008年-2009年从青岛沙子口海区14个月随机采集的10种大型海藻（孔石莼Uiva pertusa、浒苔Enteromorpha prolifera、海膜Halymenia floresia、细毛石花菜Gelidium crinale、缘管浒苔Enteromorpha Linza、舌形蜈蚣藻Grateloupialivida、扁江蓠Gracilaria textorii、节夹藻Lomentaria Lyngb、刚毛藻Cladophora、马尾藻Sargassum）中有7种（孔石莼Uiva pertusa、浒苔Enteromorpha prolifera、海膜Halymenia floresia、细毛石花菜Gelidium crinale、缘管浒苔EnteromorphaLinza、扁江蓠Gracilaria textorii、刚毛藻Cladophora)检测到病毒，带毒样品占到检测样品总数的55.56％，其中12份孔石莼样品有11份样品检测到病毒，2009年8月25日采集的孔石莼样品携带病毒数量最高，为7.68×104/0.1g。从荣成桑沟湾海区采集的14种大型海藻样品（孔石莼Uiva pertusa、浒苔Enteromorpha prolifera、海膜Halymenia floresia、细毛石花菜Gelidium crinale、舌形蜈蚣藻Grateloupia livida、节夹藻Lomentaria Lyngb、马尾藻Sargassum、江蓠Gracilaria confervoides、叉枝藻Gymnogongrus flabelliformis、石花菜Gelidium amansii、龙须菜Gracilaria lemaneiformis、金膜藻Chrysymenia Wrightii、蜈蚣藻Grateloupia filicina、海带Laminaria Japonica)中有3种（孔石莼Uivapertusa、海膜Halymenia floresia、马尾藻Sargassum）检测到病毒，带毒样品占到检测样品总数量的20.83％，其中2009年7月采集的孔石莼样品携带病毒数量最高，为3.06×103/0.1g。这一结果说明部分大型海藻均可携带AVNV，关于大型海藻携带AVNV在该病原流行传播中的作用还有待进一步研究。
　　 为分析扇贝养殖海区真核浮游生物种类和丰度，以实验室培养的9种饵料微藻为对照，PCR扩增9个月份青岛沙子口扇贝养殖海区真核浮游生物18SrDNAV1～V3区的高变区，并采用DGGE技术对扩增片段进行了分析，结果表明，扩增序列长560bp，DGGE分析可将不同藻种分离开。DGGE分析沙子口养殖区9个月份真核微生物的种类多样性，结果从9个月份2米深的海水中总共扩增出38类谱带，其中9个月共有谱带3条，占总数的7.69％，不同月份的特征性谱带11个，占总谱带数的28.2％。不同月份水样中的谱带数存在显著不同，香农多样性指数为0.4632。相似性分析表明，09年3和4月、08年5和6月份以及2008年10和12月份养殖海区真核微生物种类各自相近。基于不同月份水样微生物种类进行UPGMA聚类分析，结果表明，2008年5、6、8月份和2009年1、2、3、4月分别聚为一支，显示取样时间相近的月份微生物种类相似度最高。

目录

文摘

英文文摘

谨献

第一章 前言

1 栉孔扇贝生物学特征

1.1 外部形态特征

1.2 栖息环境

1.3 摄食

2 栉孔扇贝大规模死亡原因研究进展

2.1 栉孔扇贝大规模死亡现象流行病学特征

2.2 环境因子

2.3 生物性因子

2.4 栉孔扇贝大规模死亡病原确定

2.5 AVNV导致的扇贝组织和细胞病理变化

2.6 AVNV检测技术建立

2.7 AVNV传播途径的研究进展

3 本论文研究目的和意义

第二章 扇贝养殖海区浮游生物携带AVNV的季节性变化

1 实验材料和方法

1.1 材料

1.2 实验方法

2 结果与分析

2.1 滤集浮游生物总DNA的提取

2.2 FQ-PCR对养殖海区离心浮游生物携带AVNV的检测分析

2.3 两个养殖海区水样分级滤集的浮游生物携带AVNV的检测

2.4 浮游生物大小与携带病毒数量的关系

2.5 浮游生物携带病毒的垂直分布情况

3 讨论

第三章 扇贝养殖海区大型海藻携带AVNV的检测分析

1 材料和方法

1.1 大型海藻样品

1.2 实验方法

2 结果与分析

2.1 沙子口养殖海区大型海藻携带AVNV的检测分析

2.2 桑沟湾养殖海区大型海藻携带AVNV的检测分析

3 讨论

第四章 扇贝养殖海区真核浮游生物不同季节多样性分析

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 实验方法

2 结果与分析

2.1 提取基因组DNA纯化及完整性检测

2.2 9个培养微藻种18S rDNA V1～V3可变区序列的DGGE电泳

2.3 沙子口养殖海区9个月份海水样品18S rDNA V1～V3可变区扩增片段的DGGE指纹图谱

3 讨论

参考文献

致谢

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