贝类中诺如病毒的快速检测及超高压灭活研究

摘要

诺如病毒(norovirus，NoVs)是一组形态和生物学特征类似的无包膜的正链RNA病毒的统称，属于杯状病毒，是引起人类急性胃肠炎的重要病原，近年来在包括中国在内的世界多个国家和地区均有诺如病毒爆发和散发病例报道。由于该病毒多以食物尤其是滤食性双壳贝类如牡蛎等水产品作为传播载体，加之人们生食贝类的习惯由来已久，由贝类中的诺如病毒引起的食品安全性问题越来越受到世界各国的重视。开展贝类中诺如病毒的快速检测及灭活研究，对保障我国人民食品安全，提高出口食品质量以及创造经济价值都至关重要。
　　 诺如病毒的检测和研究一度因为无法实现体外培养而局限于电镜等成本高、灵敏度低的手段，其后发展起来的免疫学方法也因特异性太强而应用范围较窄。近年来，随着部分诺如病毒毒株的全基因序列的测定与分析，以及大量毒株部分序列的获得，越来越多的分子生物学技术以其快速、灵敏等优势得到了广泛的应用。
　　 本论文采用诺如病人腹泻粪便与牡蛎匀浆混合的方法，建立了携带诺如病毒的贝类模型。采用RT-PCR，RT-seminested PCR，RT-Real Time PCR和RT-环介导等温扩增(KT-loop mediated isothermal amplification，RT-LAMP)等分子生物学方法，分别检测贝类中的诺如病毒，并对几种方法进行综合分析。实验结果显示：牡蛎中存在的抑制物使得常规PCR的灵敏度和特异性不理想，一步法相比于两步法电泳条带清晰且消除了非特异性扩增，但对于稀释度大于100倍的样品仍然不能检出。Seminested PCR较常规PCR大大提高了检测灵敏度。但该方法操作过程比较繁杂，需要的实验时间较长，影响了该方法的普及。荧光定量PCR技术可以实现诺如病毒的定量分析，而且大大提高了检测和定性分析灵敏度，自动化程度更高。但是该方法需要荧光定量PCR仪，所用试剂也较为昂贵，难以在基层单位推广。RT-LAMP具有方便快捷、成本低等特点，具有很强的可操作性及适用性，有望成为简易的常规检测手段。
　　 虽然传统的加热烹调方法能够有效地灭活食物中的诺如病毒，但随着生鲜即食食品尤其是牡蛎等生食海产品的普及，一种全新的灭活加工手段亟待建立。超高压技术作为一种有效的灭菌消毒的物理手段已成功地应用于多个领域，因其能够很好地保持食品原有的营养价值、色泽和天然风味，在生食贝类等水产品的加工方面具有非常好的应用前景。
　　 本论文利用鼠诺如病毒(Murine norovims-1，MNV-1)作为研究替代物，建立了海水流动系统模拟贝类富集诺如病毒的模型，通过空斑实验评价了超高压技术对牡蛎体内诺如病毒的灭活效果。实验结果表明：0℃下200 MPa处理5min即可对牡蛎体内的MNV-1产生灭活效果，400 MPa处理5min可使牡蛎体内的MNV-1活力降至无检出水平。
　　 综合采用免疫学和分子生物学方法，对超高压灭活鼠诺如病毒的作用机制进行一系列初步的探讨。针对病毒基因组不同区域设计三对引物进行扩增，从而判断病毒在经过高压处理后核酸的完整性；通过酶处理-RT-PCR、抗原捕获-RT-PCR以及酶联免疫的方法，分别探讨了病毒外壳蛋白对于核酸的保护能力、病毒外壳上抗原决定簇的变化以及病毒外壳上连接受体分子的结构变化情况；采用免疫细胞化学和酶联免疫的方法探讨灭活后的病毒是否仍然能与细胞上的受体结合从而启动整个感染过程。实验结果表明：超高压对于MNV-1感染性的影响作用在与细胞上受体的粘附阶段；超高压处理后，MNV-1抗原性及RNA的完整性没有受到明显的破坏，但MNV-1蛋白外壳对壳内RNA的保护能力明显下降。
　　 环介导的等温扩增和超高压都属于国际上比较热门的新技术，在国内尤其在诺如病毒的研究中还处于起步阶段。本论文将为贝类中诺如病毒的现场快速检测奠定实验基础，并为推广超高压技术在贝类加工中的应用提供理论依据。

目录

文摘

英文文摘

1 文献综述

1.1 诺如病毒的生物学特征

1.1.1 形态学特征

1.1.2 遗传学特征

1.1.3 病毒的繁殖

1.1.4 病毒的致病性

1.1.5 病毒的传播途径

1.2 诺如病毒的检测与分析

1.2.1 电镜法

1.2.2 免疫法

1.2.3 分子生物学法

1.2.4 环介导的等温扩增技术

1.3 诺如病毒的灭活与控制

1.3.1 诺如病毒研究替代物的选择

1.3.2 灭活诺如病毒的常见方法

1.3.3 超高压技术

1.4 论文的研究意义和研究方法

参考文献

2 几种分子生物学方法检测牡蛎中诺如病毒的比较

2.1 材料与方法

2.1.1 试剂与材料

2.1.2 阳性样品的筛选

2.1.3 牡蛎的处理及病毒的提取

2.1.4 RT-PCR

2.1.5 RT-Seminested PCR

2.1.6 RT-Real Time PCR

2.1.7 RT-LAMP

2.2 实验结果

2.2.1 PCR产物的序列分析

2.2.2 RT-PCR

2.2.3 RT-Seminested PCR

2.2.4 RT-Real Time PCR

2.2.5 RT-LAMP

2.3 讨论

参考文献

3 超高压灭活牡蛎中的诺如病毒

3.1 材料与方法

3.1.1 试剂与材料

3.1.2 细胞培养与病毒繁殖

3.1.3 牡蛎中MNV-1的人工接种

3.1.4 超高压处理

3.1.5 MNV-1的提取

3.1.6 空斑实验

3.1.7 剩余感染力实验

3.1.8 RT-PCR及酶处理-RT-PCR

3.2 实验结果

3.2.1 MNV-1在牡蛎中的富集效果

3.2.2 超高压处理对牡蛎中MNV-1感染力的影响

3.2.3 空斑形成实验与分子检测方法的相关性

3.3 讨论

参考文献

4 超高压处理灭活诺如病毒的作用机制

4.1 材料与方法

4.1.1 试剂与材料

4.1.2 细胞培养与病毒繁殖

4.1.3 超高压处理

4.1.4 空斑形成实验

4.1.5 免疫细胞化学实验

4.1.6 酶联免疫实验

4.1.7 RT-PCR

4.1.8 酶处理-RT-PCR

4.1.9 抗原捕获-RT-PCR

4.2 实验结果

4.2.1 超高压处理对MNV-1感染力的影响

4.2.2 超高压处理对MNV-1侵染细胞能力的影响

4.2.3 超高压处理对MNV-1与细胞受体(神经节苷酯)结合能力的影响

4.2.4 超高压处理对MNV-1核酸完整性的影响

4.2.5 超高压处理对MNV-1蛋白外壳保护能力的影响

4.2.6 超高压处理对MNV-1抗原性的影响

4.3 讨论

参考文献

参考文献

结论

论文创新点

致谢

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