红鳍东方鲀重编程因子Oct4和Sox2原核表达载体的构建、精巢细胞原核表达产物的导入及其检测研究

摘要

重编程因子Oct4与Sox2作为转录因子,可通过开启相关基因的转录诱导体细胞的重编程,在诱导型多能干细胞(iPS细胞)的制备及相关研究中具有重要的应用价值。目前,获得哺乳动物iPS细胞的最安全的途径是直接导入外源重编程因子的编码蛋白。为了获得红鳍东方鲀精巢细胞的iPS细胞,为优质、高产、抗逆红鳍东方鲀的细胞工程育种奠定基础,本文利用pET32a与穿模肽构建出Oct4和Sox2的原核表达载体,通过转化大肠杆菌(E.coli)BL21诱导表达出其编码蛋白,经与体外培养的红鳍东方鲀精巢细胞系细胞共孵育将Oct4和Sox2的编码蛋白导入精巢细胞,并对导入编码蛋白的细胞内定位进行了检测。
　　 根据红鳍东方鲀基因组数据库中的已公布序列设计Oct4和Sox2引物,从红鳍东方鲀肝组织中克隆出Oct4和Sox2基因,在其两端分别引入BamHⅠ和KpnⅠ限制性酶切位点,在合成的由11个精氨酸组成的细胞穿膜肽序列两端引入KpnⅠ和EcoRⅠ限制性酶切位点,利用KpnⅠ酶切位点的粘性末端将穿膜肽序列分别接到Oct4和Sox2基因的3'端上,进而利用Oct4和Sox2基因的BamHⅠ酶切位点以及穿膜肽序列的EcoRⅠ酶切位点将Oct4基因、Sox2基因和穿膜肽序列连到pET32a原核表达载体中,构建出pET32a-Oct4-11R和pET32a-Sox2-11R表达质粒。将上述构建的表达载体分别转化到E.coli BL21中,分别在30℃利用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导处理5 h进行Oct4和Sox2基因编码产物的诱导表达,经过超声波和冻融破碎细胞后,对存在于细胞质中的Oct4重组蛋白表达产物直接采用Ni-NTA树脂进行纯化,对以包涵体形式存在的Sox2重组蛋白表达产物经尿素变性处理后再采用Ni-NTA树脂进行纯化,经透析获得复性的纯化蛋白,经过过滤除菌后,添加到红鳍东方鲀精巢细胞的培养液中,孵育精巢细胞过夜,光学显微镜下观察细胞形态及Western blot检测结果显示,Oct4和Sox2重组蛋白与细胞作用的最佳浓度均为8μg／ml。免疫荧光检测结果发现,导入的Oct4和Sox2重组蛋白在细胞质和细胞核中均有分布,但主要集中细胞核中,表明这两种重组蛋白均能在穿膜肽的引导下进入到细胞核中。上述实验结果证实,本文所构建的Oct4和Sox2基因表达载体能在E.coli中得到有效表达,且所引入的穿膜肽能有效介导Oct4和Sox2重组蛋白表达产物穿膜进入红鳍东方鲀精巢细胞核,导入后的红鳍东方纯精巢细胞现已存活了10天,为红鳍东方纯精巢细胞诱导转化为iPS细胞奠定了基础。