脱氧胆酸通过调节干细胞重编程因子OCT4与SOX2诱导食管鳞状上皮肠化生

摘要

背景和目的：Barrett食管（Barrett’s esophagus，BE）是指食管下段鳞状上皮被化生的柱状上皮所取代的一种病理现象，目前普遍认为BE是食管腺癌（ECA）的主要癌前病变。近年来全世界尤其是西方国家食管腺癌及BE的发病率增加，BE的研究受到广泛重视。Barrett食管的细胞来源尚不清楚，目前主要存在转定型（Transcommitment）和转分化（Transdifferentiation）两类假设，但这些假设都因缺乏直接证据而不能完全让人信服。近10年来，诱导多能干细胞的提出及运用使得转分化学说越来越受重视。BE一直被认为是胃食管反流病（GERD）的并发症，在胃食管反流人群中BE的检出率高达10％-15%。结合之前有研究证实胆汁成分中非结合胆汁酸脱氧胆酸（DCA）是导致BE发生及癌变的重要成分，我们提出：DCA等刺激可能通过调节细胞重编程因子OCT4及SOX2的表达导致成熟食管鳞状上皮细胞逆分化为具有部分分化潜能的细胞，再在环境因素的作用下转分化形成柱状上皮，进而形成 BE。本课题的目的是研究脱氧胆酸对正常食管鳞状上皮中OCT4及SOX2表达的影响，进一步探讨其在BE发生中的作用及机制，为寻找BE诊断和治疗的新靶点提供理论依据。
　　方法：
　　1.在临床标本及通过胃全切+食管十二指肠吻合的方法构建的大鼠单纯胆汁反流模型中通过免疫组化方法检测正常食管、食管炎及BE中OCT4、SOX2及肠型标记分子Cdx2、MUC2及鳞状上皮标记分子p63表达水平；
　　2.用200μmol/L的脱氧胆酸（DCA）分别处理Het-1A细胞0h、2h、4h、8h、12h，采用Real-time PCR、Western Blot等方法研究DCA对食管上皮细胞OCT4、SOX2、肠型标记分子Cdx2、MUC2及鳞状上皮标记分子p63表达的影响；
　　3.用慢病毒过表达及RNAi干扰的方法上调或下调Het-1A细胞中OCT4、SOX2的表达水平，观察其对DCA诱导肠标记分子Cdx2、MUC2的影响以及OCT4、SOX2在DCA诱导食管肠上皮化生中的作用；
　　4.观察Het-1A细胞中OCT4表达调控对SOX2表达的影响及SOX2表达调控对OCT4表达的影响，探讨食管鳞状上皮细胞中OCT4与SOX2的相互关系。
　　结果：
　　1.人体标本中，正常食管上皮OCT4不表达，少量食管炎中OCT4呈微弱核表达，Barrett腺体及周边鳞状组织OCT4表达较正常食管及食管炎组织明显升高。正常食管、食管炎、BE中SOX2表达逐渐下调；
　　2.临床标本中，BE中肠型标记分子Cdx2、MUC2表达较正常食管、食管炎上调，鳞状上皮标记分子p63表达下调；
　　3.通过胃全切+食管十二指肠吻合术成功构建了单纯胆汁反流的大鼠模型成功诱导了BE形成。大鼠模型中OCT4、SOX2及肠型标记分子Cdx2、MUC2及鳞状上皮标记分子p63表达与人体标本一致；
　　4.体外实验证实DCA处理能够时间依赖性地上调鳞状上皮细胞中OCT4的表达同时下调SOX2表达，并且DCA处理能诱导肠型标记分子Cdx2、MUC2的表达；
　　5.干扰OCT4后肠型标记分子下调趋势，OCT4干扰削弱了DCA处理对肠型标记分子的上调作用。单独过表达OCT4并不足以诱导Cdx2、MUC2的表达；
　　6.干扰掉SOX2后肠型标志Cdx2及MUC2上调，并且对DCA诱导肠型分化表现出协同作用，过表达SOX2会导致肠型标志物表达下调；
　　7.干扰或过表达OCT4未影响SOX2表达变化，同样干扰或过表达SOX2也未影响OCT4表达变化。
　　结论：
　　1.OCT4及SOX2可能在胆汁反流诱导BE形成的过程中起重要作用；
　　2.大鼠模型中，单纯胆汁反流能够成功诱导食管炎及BE的形成；
　　3.脱氧胆酸通过上调干细胞重编程因子OCT4及下调SOX2诱导成熟的鳞状上皮转分化形成肠型柱状上皮；
　　4.干扰或过表达OCT4并没有影响SOX2表达变化，反之亦然，提示OCT4在食管上皮细胞转分化过程中可能有其他的协同因子。

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前言

第一部分 人体正常食管、食管炎、BE组织中OCT4与SOX2的表达

1.1 材料和方法

1.2 结果

1.3 讨论

第二部分 大鼠反流模型中正常食管、食管炎、BE中OCT4与SOX2的表达

2.1 材料与方法

2.2 结果

2.3 讨论

第三部分 脱氧胆酸处理对食管鳞状上皮细胞OCT4/SOX2及肠化标记分子表达的影响

3.1 材料与方法

3.2 结果

3.3 讨论

第四部分 干扰及过表达OCT4/SOX2对食管鳞状上皮细胞肠型分化的影响

4.1 材料与方法

4.2 结果

4.3 讨论

全文结论

参考文献

文献综述: Barrett食管发生机制研究进展

研究生期间发表的文章

致谢