动物组织中微量糖链结构分析方法的建立及应用

摘要

本论文以C57BL/6J小鼠肝脏、肾脏及心脏为研究对象,运用多种现代提取分离与分析技术,建立了一种系统分析微量组织中神经节苷脂(ganglioside,GLs)、N-糖链及糖胺聚糖(glycosaminoglycan,GAGs)的分析方法,并将所建立的方法首次应用于人宫颈癌细胞(HeLa)中N糖链和2型糖尿病小鼠(db/db)肾脏中GAGs组成及其精细结构差异性研究。在此基础上,以所得内源性糖链和外源性海洋糖链为原料,利用糖生物芯片技术,首次研究了GLS及海洋拟寡糖脂(NGLs)与甲型流感病毒(influenza A virus,H1N1)神经氨酸酶(neuraminidase,NA)的结合作用,探讨和分析了内源性GAGs和海洋酸性多糖与结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)的结合特性。
　　得出的主要结论如下:
　　(1).利用高效薄层色谱(HPTLC)和电喷雾质谱(ESI-MS)联用技术,建立了一种可适用于不同组织中微量GLS组成的快速分析方法。以C57BL/6J小鼠肝脏、肾脏和心脏组织为研究对象,首次对其组织中GLS进行比较分析。结果表明,不同组织来源的GLS的种类及组成存在较大差异。C57BL/6J小鼠肝脏中以GM1和GM2为主,心脏中主要含GM1、GM2和GT1a,而肾脏中5种GLS(GM3、GM2、GM1、GD1a和GT1a)含量差异不大。肝脏中GLS的种类和含量最多,与其作为脂类代谢的主要器官有关。
　　(2).以C57BL/6J小鼠肾脏为研究对象,建立了一种从同一组织中分步释放微量N-糖链和GAGs的分析方法。研究表明,C57BL/6J小鼠肾脏中主要是硫酸乙酰肝素(heparan sulfate,HS)。N-糖链轮廓分析表明,小鼠肾脏有60种复杂多样的N-糖链,其中高甘露糖型所占比例较大,多数N-糖链含有乙酰神经氨酸(NeuAc)和岩藻糖(Fuc)。利用所建立的N-糖链分析方法,首次全面分析了HeLa细胞膜表面N-糖链的结构。在获得的34种N-糖链中,除存在高甘露糖型N-糖链,二天线、三天线、四天线和五天线等复杂型N-糖链外,还发现了与肿瘤发生和转移相关的平分型和Lewis糖链结构。
　　(3).建立了一种适用于动物组织中微量GAGs精细结构分析方法,并将其应用于2型糖尿病小鼠肾脏组织中GAGs的精细结构差异性分析。采用2-氨基吖啶酮(2-aminoacridone,2-AMAC)荧光标记柱前衍生高效液相色谱法,比较分析了C57BL/6J正常组小鼠,db/db糖尿病模型组小鼠和海洋寡糖药物HS203给药组小鼠肾脏中GAGs的种类及二糖组成结构差异性。首次发现db/db糖尿病组小鼠肾脏中HS较正常组N-硫酸化程度降低,而海洋寡糖药物HS203可显著提高病变组肾脏中HS硫酸化程度,表明HS203具有治疗糖尿病肾病作用。
　　(4).利用寡糖芯片技术,首次比较分析了6种内源性GLS及36种海洋红藻来源拟寡糖脂与甲型流感病毒NA的特异性结合作用。结果表明,36种海洋来源的不同类型的卡拉胶寡糖及琼胶寡糖与NA蛋白的结合强度绝大多数都强于内源性GLS,且这种结合强度与寡糖硫酸根的有无、糖残基种类、连接方式及聚合度大小等相关。值得提出的是,在42种寡糖中,脱硫λ-卡拉胶dsL7与NA结合力最强。
　　(5).利用多糖芯片技术,首次探讨了内源性GAGs和海洋酸性多糖与2型糖尿病肾病相关因子CTGF的结合作用,并发现硫酸化程度和糖醛酸含量是影响CTGF与硫酸乙酰肝素类多糖识别的关键因素。
　　综上,通过动物组织中GLS、N-糖链及GAGs快速分析方法的建立及该方法的成功应用,一方面可为糖组学研究提供了可靠方法,有利于寻找新的疾病标志物,并为疾病的早期诊断治疗提供新的途径;另一方面,将有利于从GAGs细微结构的改变上评价药物的有效性,并有利于阐释糖链在相关疾病发生发展的生物学作用,并为以此开发糖类药物提供方法学基础。