利用非转染人角膜基质细胞系体外重建组织工程人角膜基质的实验研究

摘要

角膜位于眼球最前端中央处，是组成眼球外壁的透明纤维膜，主要具有防御和屈光等多种功能。人角膜基质(Human Corneal Stroma，HCS)层由人角膜基质细胞(HumanCorneal Stromal Cell，HCSC)和200余层胶原纤维层构成，约占角膜厚度的90％，位于角膜上皮层和内皮层之间。各种疾病造成的角膜基质不可逆性混浊是致盲的主要原因，角膜病是仅次于白内障的第二大致盲因素，严重影响视力且患者人数每年还在增加。角膜移植是目前治疗角膜盲的主要有效方法，但由于捐献的角膜供体高度匮乏，无法满足众多角膜病患者复明的需求。体外重建的组织工程人角膜组织，作为捐献角膜的等效替代物，是目前解决角膜供体材料来源缺乏的有效途径，也是使众多HCS异常眼病患者复明的希望，更为组织工程全层人角膜的体外重建奠定了基础，因此急需开展组织工程人角膜基质(Tissue-engineered Human Corneal Stroma，TE-HCS)的体外重建研究。 组织工程角膜就是利用组织工程技术以及生物材料或人工合成材料为载体，将角膜的种子细胞接种在载体支架上进行培养，在体外重建出形态结构和功能与在体人角膜相近的角膜组织替代物。而TE-HCS体外重建的两个基本要素分别是HCS种子细胞和载体支架材料。目前，作为角膜基质的种子细胞主要有原代细胞和转染的永生化细胞，但均存在缺陷并限制了在TE.HCS中的应用。本研究室建立了非转染、无致瘤性的HCSC细胞系解决了种子细胞来源的这一难题。胶原是构成动物细胞外基质的主要成分，不同种类动物来源的胶原的化学及生物学特征具有高度相似性，同时胶原具有低免疫原性、低毒性、低抗原性，而且来源广泛，其具有良好的生物相容性和生物可降解性，很早就被应用于组织工程的天然生物材料，本文选用胶原蛋白制备复合胶原凝胶支架作为TE-HCS体外重建的载体支架。 为了检验业已建立的非转染HCS细胞系细胞用作TE-HCS体外重建种子细胞的可行性，本文对HCSC的细胞属性及功能进行了进一步鉴定。对第100代HCSC的生长曲线和染色体组型分析检测结果显示，培养在含10％胎牛血清的DMEM/F12(1:1)培养液的HCSC在低密度状态下保持树枝状，长满单层时呈纤维样，细胞生长分裂旺盛，其群体倍增时间为41.44 h，其特征性染色体数目仍然为2n=46。对第100代HCSC的细胞免疫化学鉴定结果显示，HCSC能够表达HCSC特异性标志蛋白-波形蛋白；连接蛋白-整联蛋白β1和间隙连接蛋白-43的表达为阳性；功能蛋白-乙醛脱氢酶3A1、钠钾泵和钙泵表达为阳性，这表明该细胞仍具有HCSC的细胞属性、能形成细胞间连接和发挥功能HCSC的功能。对第100代HCSC的致瘤性检测结果显示，该细胞系细胞无致瘤性，可以安全用于TE-HCS的体外重建及其临床应用研究。可见，业已建立的非转染HCS细胞系细胞可被用作TE-HCS体外重建的种子细胞。 为了获得TE-HCS体外重建的理想载体支架，本文利用人源Ⅰ型、Ⅴ型和Ⅳ型胶原蛋白以及人源纤连蛋白和硫酸软骨素为原料，以EDC/NHS(1-[3-二甲基氨基丙基]-3-乙基碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺)为交联剂制备了复合胶原凝胶(COL-CS-Gel)支架，并根据不同类型胶原的所占总胶原量的比例做了不同的组合。通过石蜡切片苏木精.伊红(HE)染色、扫描电镜对制备的复合胶原凝胶支架进行了鉴定。结果显示：COL-CS-Gel 1(组1)表面具有一定的空隙结构，内部结构松散；COL-CS-Gel 2表面错落相叠压，没有规则的空隙，内部结构有连接，但不均匀；COL-CS-Gel 3表面结构致密，没有形成空隙，内部结构不均匀；COL-CS-Gel 4表面具有一定的空隙结构，但没有形成完整的孔隙，内部结构均匀；COL-CS-Gel 5表面孔径在100 μm左右，内部结构均匀，是最佳的一个组合。另外对COL-CS-Gel 5进行了鉴定，结果表明其透光性良好，透光率在90％左右，含水量为89.3％±4％。因此，COL-CS-Gel 5适合用于TE-HCS体外重建。
　　为了检测所制备COL-CS-Gel 5的最适细胞迁入时间及生物相容性，本文通过冰冻切片HE染色及组织免疫化学方法对其进行了鉴定。在接种3 d、5 d、7 d及9 d后，HCSC在支架内部迁入良好、均匀分布。免疫化学鉴定显示HCSC中波形蛋白、整联蛋白β1、间隙连接蛋白-43、乙醛脱氢酶3A1、钠钾泵、钙泵等表达为阳性，说明COL-CS-Gel 5与HCSC的生物相容性较好，可以用于TE-HCS体外重建。 为了建立TE-HCS的体外重建的方法，本文利用生长状态良好、非转染、无致瘤性的HCSC为种子细胞，以复合胶原凝胶COL-CS-Gel 5为载体支架，使用含10％胎牛血清的DMEM/F12(1:1)培养液，于37℃、5％CO2的培养条件下，进行了TE-HCS的体外重建研究，并利用冰冻切片HE染色、免疫化学、扫描电镜和透射电镜等方法对重建TE-HCS的形态结构、潜在功能等方面进行了鉴定。结果显示在培养3 d后，细胞在重建TE-HCS内均匀分布，细胞平展于胶原面上，并多处形成细胞-基质之间的连接。同时，细胞-细胞间也存在细胞连接。免疫化学鉴定显示波形蛋白、整联蛋白β1、间隙连接蛋白-43、乙醛脱氢酶3A1、钠钾泵、钙泵等表达为阳性。这表明体外重建的TE-HCS具有与正常角膜基质相似的形态结构，且体外重建的TE-HCS具有发挥HCS生物学功能的潜能。最后，对所得TE-HCS利用新西兰兔角膜基质移植进行了初步的功能检测，在体观察到10 d。 综上所述，第100代非转染HCSC生长状态良好、增殖分裂旺盛；染色体特征正常；HCSC的标志性蛋白、连接蛋白、功能蛋白表达为阳性，且无致瘤性。同时，利用人源Ⅰ型、Ⅴ型和Ⅳ型胶原蛋白以及人源纤连蛋白和硫酸软骨素为原料，以EDC/NHS为交联剂制备的复合胶原凝胶支架COL-CS-Gel 5对HCSC的生物相容性好。然后利用本研究室所建立的非转染、无致瘤性HCSC及新制备的复合胶原凝胶支架COL-CS-Gel5成功体外构建出了TE-HCS。