海洋芽孢杆菌B-9987基因组文库的构建及Macrolactins生物合成基因簇的克隆与鉴定

摘要

海洋芽孢杆菌B-9987(Bacillus marinus)分离于我国渤海潮问带植物盐地碱蓬(Suaeda salsa)的根部,能够产生丰富的Macrolactins类化合物。Macrolactins是一系列24元大环内酯类化合物,主要分离自Actinomadura sp.和Bacillus sp.等海洋来源的微生物之中,具有广泛的抗菌、抗病毒和抗肿瘤等生物学活性。本论文以海洋芽孢杆菌B-9987为研究对象,主要开展了以下研究工作:
　　首先,成功构建了海洋芽孢杆菌B-9987的基因组文库。从B-9987中提取基因组DNA,经过Sau3AI部分酶切,脱磷,回收40kb左右的DNA片段,与经XbaI酶切并脱磷,再用BamHI处理的载体SuperCosl相连接,连接产物经包装蛋白包装,然后侵染宿主细胞Ecoli Trans10,构建成海洋芽孢杆菌B-9987的基因组文库。对该文库进行了质量鉴定,结果表明:文库的效价达5×105 cfu/mL,共得到2×104个阳性克隆子,平均插入长度为35kb,插入率接近100％,覆盖率为4.4。所建文库的各项指标均达到要求,克隆子分装保存于-80℃。基因组文库的构建为次级代谢产物生物合成基因簇的克隆,以及异源表达奠定了基础。
　　其次,对海洋芽孢杆菌B-9987的发酵条件与收获时间进行了摸索与优化。结果表明:采用两步法,以LB培养基作为种子培养基,在28℃,200rpm振荡培养16 h,获得种子液,将种子按10％接种量接种至50/250mL三角瓶的Landy发酵培养基中,同样条件下再培养12 h,为合适收获时间。
　　接着,对海洋芽孢杆菌B-9987中Macrolactins生物合成基因簇进行了克隆与生物信息学分析。研究结果表明,Macrolactins的骨架是由bmmA-I(bmb1676-1683)编码的8个聚酮合酶以丙二酰CoA为延伸单位,经11轮克莱森缩合反应催化组装而成,其中bmmA(bmb1676)编码了反式-酰基转移酶(trans-AT)。本论文构建了用于bmmA双交换同源重组的质粒,采用电转化方法将其导入野生型菌株B-9987之中,通过抗性筛选(strR)和PCR验证,获得了三株阻断突变株。对野生型菌株和bmmA突变株进行发酵,经HPLC-MS分析表明:三个突变株均不产生Macrolactins类化合物,证实了bmmA是Macrolactins生物合成所必须的关键酶。