海洋芽孢杆菌B-9987中Macrolactins生物合成相关基因功能研究

摘要

海洋芽孢杆菌（Bacillus marinus）B-9987是从我国渤海潮间带植物盐地碱蓬（Suaeda salsa）的根中分离得到的内生细菌，具有产生丰富次级代谢产物的能力，其中能够产生丰富的Macrolactins化合物。该类化合物是一系列24元大环内酯类化合物，其骨架是由反式酰基转移酶的聚酮合酶组装而成，之后经过后修饰步骤，如酰基化、糖基化等，形成不同的Macrolactins化合物。本论文以海洋芽孢杆菌B-9987为研究对象，采用生物信息学、生物化学、分子生物学、天然产物化学等手段，对Macrolactins生物合成相关基因及关键酶进行了功能研究，具体研究工作如下:
　　一方面，对Macrolactins生物合成相关调控基因进行了定位与初步的功能研究。采用生物信息学手段对海洋芽孢杆菌B-9987的基因组中可能与Macrolactins生物合成相关调控基因的分析结果表明基因bm0677编码了一个GntR家族的转录调控因子。进一步，采用双交换同源重组和基因高表达策略研究了调控基因bm0677的功能。对野生株、突变株和高表达株进行发酵，经HPLC分析发现，随着发酵时间的延长，在同一发酵时间点下，突变株相较于野生株而言，糖基化的化合物产量降低了而酰基化的化合物产量提高了。由此推测基因bm0677对B-9987中的糖基化修饰过程起正调控作用而对酰基化修饰起负调控作用。随后又从菌落形态和生物膜形成两个方面对突变株的野生株的形态进行了观察研究，菌落形态实验结果表明野生株的菌落生长比较干燥，突变株的菌落生长比较湿润。而生物膜形成的实验结果表明野生株有生物膜的形成，突变株没有生物膜的形成。形态观察结果表明基因bm0677对野生株的形态也有一定的影响。
　　另一方面，对Macrolactins糖基转移酶BmmGT1的酶反应条件进行了研究。分别从反应时间，酶浓度和底物浓度三个角度对酶反应条件进行了优化，结果表明在0.2mM的Macrolactin A，8μM的BmmGT1和4mM的UDP-葡萄糖的条件下，BmmGT1能够以UDP-葡萄糖为糖基供体将葡萄糖转移至Macrolactin A的多个羟基上(7-OH/13-OH/15-OH)，并在此基础上分离和鉴定了4种新的Macrolactins糖基化产物。
　　以上结果为阐明Macrolactins生物合成分子调控机制奠定了必要的基础，另外通过BmmGT1酶反应条件的摸索，获得了4个新的Macrolactins糖基化化合物，这为新药研究提供了物质基础。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1 研究背景

1．2 海洋来源的芽孢杆菌产生的活性物质

1．2．1 脂肽类化合物

1．2．2 异香豆素类

1．2．3 脂肪酸类

1．2．4 聚酮类化合物

1．2．5 糖苷类

1．3 糖基转移酶

1．3．1 糖基转移酶的结构类型

1．3．2 糖基转移酶的分类

1．3．3 糖基转移酶的作用机制及糖基侧链改造

1．4 Macrolactins生物合成研究

1．5 课题研究目的及意义

第二章 海洋芽孢杆菌B-9987中Macrolactins生物合成相关调控基因的研究

2．1 引言

2．2 实验材料

2．2．1 菌株与质粒

2．2．2 引物

2．2．3 所用培养基和生化试剂

2．2．4 主要实验试剂及仪器

2．3 实验方法

2．3．1 大肠杆菌质粒DNA的提取

2．3．2 芽孢杆菌质粒DNA的提取

2．3．3 芽孢杆菌总DNA的提取

2．3．4 琼脂糖凝胶电泳中DNA片段的胶回收(参照OMEGA试剂盒说明书)

2．3．5 连接反应

2．3．6 大肠杆菌感受态细胞的制备及电转化

2．3．7 大肠杆菌中质粒的快速抽提检测

2．3．8 海洋芽孢杆菌B-9987电转化感受态细胞的制备及电转化

2．3．9 PCR及相关技术

2．3．10 B-9987发酵及发酵液的HPLC分析

2．3．11 生物膜观察

2．4 结果与分析

2．4．1 bm0677基因的生物信息学分析

2．4．2 基因bm0677的双交换阻断突变株的构建

2．4．3 基因bm0677的高表达株的构建

2．4．4 突变株和高表达株的表型分析

2．5 本章小结

第三章 BmmGT1酶反应条件研究

3．1 引言

3．2 实验材料

3．2．1 实验菌株

3．2．2 所用培养基

3．2．3 实验试剂及仪器

3．3 实验方法

3．3．1 酶反应底物的制备

3．3．2 蛋白质的表达纯化

3．3．3 聚丙烯酰胺凝胶电泳

3．3．4 蛋白质浓度测定

3．4 结果与分析

3．4．1 酶反应底物Macrolactin A的制备分离

3．4．2 BmmGT1的纯化表达

3．4．3 BmmGT1的酶反应条件的摸索

3．5 本章小结

第四章 新颖结构Macrolactins的制备及结构鉴定

4．1 引言

4．2 实验材料

4．2．1 主要实验仪器

4．3 实验方法

4．3．1 糖基化产物的分离方法

4．4 结构解析

4．4．1 化合物10的结构解析

4．4．2 化合物11的结构解析

4．4．3 化合物12的结构解析

4．4．4 化合物13结构解析

4．5 本章小结

第五章 总结与展望

5．1 工作总结

5．2 主要创新点

5．3 工作展望

参考文献

致谢

符号简写(Abbreviation)

个人简历、在校期间发表的学术论文