海洋产蛋白酶菌的分离、培养及其防污活性研究

摘要

海洋微生物由于种类繁多、分布广泛且可以代谢产生大量不同于陆生生物的活性物质而成为生物学和防污工程研究的热点。对海洋微生物的筛选及对其代谢产物防污活性的可行性评价是将其应用于船舶防污领域是否成功的关键因素之一。蛋白酶是一种优良的酶制剂，具有容易获得、生物可降解性和环保、低毒等优点，随着生物防污技术在船舶防污领域的发展，蛋白酶防污受到广泛的关注。
　　本文以新鲜海水为原材料，采用平板菌落划线法分离出海洋微生物蛋白酶产生菌并经紫外辐照诱变选育；通过改变培养基组分，考察不同碳氮源对其蛋白酶活性的影响；通过改变各种环境参数，找出影响该海洋微生物蛋白酶活力环境参数和规律，建立了防污微生物的发酵条件；研究了环境因素对蛋白酶活性的影响；并考察了此株海洋微生物蛋白酶产生菌蛋白酶粗提液对贻贝（Mytilus edulis）、硅藻（Navicula exigua）、藤壶金星幼虫（Balanus albicostatus cyprid）、硫酸盐还原菌（SRB）等几种典型海洋污损生物的防污附着效果。
　　通过对此株海洋微生物蛋白酶产生菌培养基进行一系列优化，筛选到此菌株的最佳培养基为：酪蛋白4.0 g；玉米浆干粉0.5 g；磷酸二氢钾：0.36 g；磷酸氢二钠：1.3 g；七水合硫酸锌：0.02 g；七水合氯化钙：0.002 g；酪素水解氨基酸：0.05 g；过滤陈海水1 L。
　　全面了解海洋微生物蛋白酶产生菌的性质，有助于我们在此基础上提高海洋蛋白酶的活性应用于船舶防污领域。为了充分了解培养过程中各环境参数的变化对海洋微生物蛋白酶产生菌蛋白酶活性的影响，本论文还研究了除培养基组份外的其他影响因素对海洋微生物蛋白酶产生菌蛋白酶活性的影响，包括pH值、培养时间、金属离子等环境因子。福林酚试剂测定蛋白酶活力结果显示：pH值对蛋白酶活性影响显著，随着pH值由6-8.5的变化，蛋白酶活性呈先上升后下降的趋势，且在 pH为7时达到最大值；对海洋微生物蛋白酶产生菌进行为期5d的摇床发酵培养，每隔24 h测定蛋白酶粗提物酶活力，监测到该菌株蛋白酶活力在第二天时达到最大；高浓度金属离子对海洋微生物蛋白酶产生菌酶活力有一定程度的抑制作用，而低浓度的金属离子对蛋白酶活性抑制不明显。另外，由于低盐度水平不能维持海洋微生物蛋白酶产生菌生长代谢所需渗透压，随着盐度的降低，蛋白酶活性呈下降趋势。
　　通过对硅藻（Navicula exigua）、贻贝（Mytilus edulis）、藤壶金星幼虫（Balanus albicostatus cyprid）、SRB等几种典型海洋污损生物的防污活性测试，考察了海洋微生物蛋白酶产生菌粗提物的防污活性。与对照组相比，加入粗酶液的实验组污损生物在基底材料表面的附着数量明显降低，初步说明此蛋白酶具有良好的防污活性；防污活性测试后，对贻贝和白脊藤壶金星幼虫进行毒性试验，结果表明：当把经粗酶提取液处理后的贻贝和白脊藤壶金星幼虫放入过滤过的陈海水中后，附着数目与对照组相比无明显差别。这进一步证明该蛋白酶不仅防污活性良好而且无毒，环保，是一种潜在的环境友好型防污活性添加剂。
　　白脊藤壶广泛存在于热带和亚热带海域，是一种分布极为广泛的海洋污损生物，具有繁殖迅速、繁殖周期短等特点；另外，白脊藤壶金星幼虫（Balanus albicostatus cyprid）通过自身分泌的胶状物附着在船舶及水下工程材料表面，不仅会影响仪器设备的正常使用，还会造成严重的经济损失。因此，研究白脊藤壶金星幼虫的附着印迹对于开发新型防污材料及防污功能性添加剂具有不可忽视的重大意义，本实验以醋酸纤维素膜和玻璃作为基底材料，研究白脊藤壶金星幼虫的附着印迹，为分析藤壶金星幼虫分泌物的组分及新型防污剂的开发提供理论依据。
　　综上所述，本文通过分离海洋微生物蛋白酶产生菌，探讨了海洋细菌蛋白酶粗提物的防污机理；研究了影响防污蛋白酶活性的各类环境因子；并对此蛋白酶进行了防污活性测试及毒性试验，证实了该蛋白酶无毒、环保、具有优良的防污活性。

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0.前言

0.1生物污损概述

0.2生物污损防污措施的研究进展

0.3酶类防污概述

0.4本论文的选题依据和研究内容

1.海洋微生物蛋白酶产生菌的分离及发酵条件的优化

1.1材料

1.2 方法

1.3 结果

1.4 小结

2 金属离子及盐度对海洋微生物蛋白酶酶活力的影响

2.1材料

2.2方法

2.3结果

2.4 小结

3.海洋微生物蛋白酶产生菌发酵产物防污活性研究

3.1材料

3.2 方法

3.6 结果

3.7 小结

4白脊藤壶金星幼虫附着印记的研究

4.1材料

4.2方法

4.3结果

4.4小结

全文总结

参考文献

致谢

个人简历

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