坚强芽孢杆菌和短小芽孢杆菌表达载体构建的分析

摘要

有益菌(Probiotics)在工业生产和水产养殖中已有广泛的应用，芽孢杆菌(Bacillus)作为益生菌中的重要组成，作为微生态制剂或生物絮团的―添加剂‖在对虾的规模化养殖中产生了很高的经济效益。在水生动物疾病频发的形势下，病害微生物防控技术受到科学家的推崇，而芽孢杆菌以其独有的优势备受青睐。本实验采用的坚强芽孢杆菌(B. firmus)和短小芽孢杆菌(B. pumilus)均分离自正常的海水环境的野生菌。为了探索利用野生型芽孢杆菌进行对虾白斑综合征(whit spot syndrome, WSS)防控的新途径，分析以上两种菌在表达载体系统构建方面的应用潜力，为选择合适的表达载体宿主菌和构建稳定、高效的表达系统提供元件、方法。
　　本论文研究内容共包括四部分：(1)坚强芽孢杆菌的鉴定及其16S-23S rDNA间区多态性分析；(2)坚强芽孢杆菌电转化方法的尝试；(3)坚强芽孢杆菌p43、hag基因的克隆及坚强芽孢杆菌特异性检测方法的建立；(4)短小芽孢杆菌应用于表达载体构建的潜力分析。
　　1.坚强芽孢杆菌的鉴定及其16S-23S rDNA间区多态性分析：利用16S rDNA序列分析与系统发育分析表明PC004和PC024均为B. firmus。利用16S-23S rDNA ISR PCR方法，2株B. firmus共得到11条16S-23S rDNA间区特征区带(包括300bp、400bp、500bp和600bp等)序列，ISR类型包括ISR0、ISRG、ISRIA和ISRGLV四种，其中ISR0、ISRG和ISRIA可能在B. firmus中普遍存在。相同类型的ISR序列具有较高的相似性(达52.2％-100.0%)，而不同类型的ISR序列间差异较大。此外，ISR序列在靠近16S和23S区域存在不同长度的保守区域，可能成为针对B. firmus特异性检测的引物和探针的靶区。
　　2.坚强芽孢杆菌电转化方法的尝试：尝试了用Xue et al(1999)报道的方法制备B. firmus PC004感受态细胞，并用pAD4412载体电转化B. firmus，但并没有实现质粒的有效转化。
　　3.坚强芽孢杆菌p43、hag基因的克隆及坚强芽孢杆菌特异性检测方法的建立：首先，克隆了B. firmus的p43基因(431bp)。其次，简化的Leifson法(Clark,1976)成功染色B. firmus鞭毛，并确定其鞭毛为单端极生鞭毛，数量2根。再次，LC-MS/MS分析了得到了B. firmus鞭毛蛋白的18条肽段序列信息。通过FCD-PCR和染色体步移获得了鞭毛蛋白的编码基因hag的全序列(GenBank Accession No. KC683536)。该基因全长1661bp，有一个开放阅读框(open reading frame, orf)编码414个氨基酸，预测分子量为44.2kDa，推断hag基因启动子核心元件-10区和-35区被σD识别，并在其上游存在A+T富集区可能增强转录起始，在下游存在核糖体结合位点(ribosome binding site, RBS)(GGAGG)，且最后一个G与ATG间隔9nt。预测了可能具有启动子活性的Phag。此外，该基因含有一段B. firmus特异性肽段的编码序列。利用I-TASSER预测了鞭毛蛋白的结构模型。然后，根据特异性肽段的编码序列设计的引物Bfspec和Bfspec2能够实现对B. firmus的特异性检测，并建立了巢式PCR检测方法。
　　4.短小芽孢杆菌应用于表达载体构建的潜力分析：抗生素的敏感试验表明该菌(201005130501)对氨苄青霉素敏感。BIOLOG分析了B. pumilus对95种碳源的利用情况，该菌是淀粉和阿拉伯糖等的缺陷型。确定了B. pumilus平均传代时间为45.51±0.11min。分离得到了B. pumilus中一隐性质粒pBP6000(GenBank Accession No. KC683537)，是小型滚环复制型质粒，属于pC194家族。全长5664bp，主要包括4个orf，编码复制起始蛋白(replication initiation protein)，DNA结合蛋白(DNA-binding protein)和aspartate phosphatase response regulator等。天然质粒可以提供载体构建所需要的载体骨架和元件等，增加可利用载体的资源。分离得到了短小芽孢杆菌中DNA解旋酶基因pcrA基因(GenBank No. KC683535)，PcrA解旋酶可能参与了pBP6000的复制和拷贝数的控制。但是，目前并没有有效的途径可以消除pBP6000，十二烷基磺酸钠(SDS)和吖啶橙(acridine orange, AO)并没有达到消除质粒的目的。
　　综上所述，本研究阐述了坚强芽孢杆菌16S-23S rDNA间区的多态性，从基因水平上分析了菌株间的差异；成功克隆了B. firmus的p43和hag基因，并根据hag基因的部分核酸序列建立了B. firmus特异性检测方法；完成了短小芽孢杆菌一个隐性质粒的全序列测序和分析工作。此外，本研究虽未成功构建出芽孢杆菌表达系统，但是，失败的经验为该方面的突破性进展有所助益，可能提供有效的分析方法。同时，部分失败的研究的原因和解决方案应该更深入地思考、总结和交流。

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第一章 前言

1.1 对虾养殖业面临的问题

1.2 芽孢杆菌在对虾疾病防治中的应用

1.3 芽孢杆菌表达载体系统的探索

1.4 芽孢杆菌表达系统构建所面临的问题及发展方向

1.5 本论文的研究目的

第二章 坚强芽孢杆菌的鉴定及其16S-23S rDNA间区多态性分析

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第三章 坚强芽孢杆菌电转化方法的尝试

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第四章 坚强芽孢杆菌p43、hag基因的克隆及坚强芽孢杆菌特异性检测方法的建立

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第五章 短小芽孢杆菌应用于表达载体构建的潜力分析

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

全文总结

参考文献

致谢

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