双抗体夹心ELISA定量检测对虾白斑综合征病毒(WSSV)方法的建立与应用

摘要

对虾白斑病是对虾养殖中危害最大的疾病之一，目前没有有效的治疗手段，因而白斑病的检测成为重要的研究内容。双抗夹心ELISA是一种实验室常用的检测方法，其灵敏度和特异性较高、重复性较好。本文以兔抗对虾白斑综合征病毒（WSSV）多克隆抗体作为捕获抗体，以抗WSSV单克隆抗体作为检测抗体，建立了双抗体夹心ELISA定量检测WSSV的方法，并制作了应用该方法检测WSSV的标准曲线。具体研究内容和结果如下：
　　（1）兔抗WSSV血清的制备：感染WSSV的中国对虾虾鳃冰浴研磨液经差速离心和不连续蔗糖密度梯度离心分离获得WSSV精提液，电镜下观察其纯度高、病毒粒子完整。取0.5mg提纯的WSSV与等量弗氏完全佐剂充分混匀皮下多点注射免疫新西兰大白兔；2周后第1次加强免疫，将WSSV与等量弗氏不完全佐剂混匀，皮下多点注射；此后每隔1周进行第2次和第3次加强免疫，采用皮下多点注射提纯的白斑综合征病毒。第3次加强免疫6d后收集抗血清。间接ELISA测得兔抗WSSV血清的效价为4×105。
　　（2）WSSV单克隆抗体腹水的制备和纯化：复苏抗WSSV杂交瘤细胞株2E6、2A3并在24孔板中培养。用RPMI1640培养基将杂交瘤细胞从24孔板轻轻吹洗下来，1000rpm离心3min，用少量RPMI1640培养基重悬细胞沉淀后吸入注射器，注射到BALB/c小鼠腹腔。待小鼠腹腔膨大后取出腹水，采用辛酸-硫酸铵法纯化腹水，SDS-PAGE结果显示单抗纯度较高。采用考马斯亮蓝法测定2E6、2A3的蛋白浓度分别为10mg/mL和5mg/mL。Western-blot结果显示两种单抗均为IgG。
　　（3）双抗体夹心ELISA建立定量检测WSSV的方法：以兔抗WSSV血清为捕获抗体，WSSV单抗2E6和2A3按1:1（V/V）混合作为检测抗体。测定捕获抗体效价为4×105，检测抗体效价为6400。采用棋盘法确定捕获抗体和检测抗体的最适工作浓度分别为3200倍和50倍。优化条件后，确定包被条件为4℃过夜，封闭条件为4％BSA于37℃封闭1h，发色条件为8mg/mL pNPP发色液避光发色，从而确定双抗体夹心ELISA的操作步骤。双抗体夹心ELISA测定12.5~51200倍梯度稀释的已知浓度的WSSV溶液，得到一组OD405值-WSSV浓度对数值的数据，经过非线性拟合得到一个四参数logistic方程标准曲线，浓度范围为7.5~30720ng/mL。取logistic方程标准曲线中线性相关系数大于0.99的7个连续的有效点，拟合出一个线性的标准曲线，浓度范围为120~7680ng/mL，该方法的最低检测限120ng/mL。其恢复率范围为84.82%~113.4%，板内重复率CV%值为2.34~7.11，板间精确率CV%值为2.18~6.9。
　　（4）标准曲线的应用：应用双抗体夹心ELISA定量检测人工感染 WSSV克氏原螯虾组织中WSSV的增殖。实验组和对照组分别有200只健康克氏原螯虾，暂养一周（PCR检测无WSSV），水温逐渐升至25℃。实验组投喂含WSSV的饵料，对照组投喂不含WSSV的饵料。84h内每隔12h分别从实验组和对照组随机抽取8只活虾，取鳃、血淋巴、肝胰腺、心脏、性腺、肠、肌肉，血淋巴按1:1（V/V）加入抗凝剂，其余组织按1g组织加入2mL 0.01mol/L PBS冰浴研磨3~5min，4℃下4000rpm离心10min，上清液-20℃保存备用。
　　感染WSSV的克氏原螯虾最早于24h血淋巴、肠、性腺中检测出WSSV阳性；36h时所有被检测的克氏原螯虾组织均检测为WSSV阳性，其中血淋巴、肠、性腺的病毒含量明显高于鳃、肝胰腺、肌肉、心脏的病毒含量。病毒在组织中含量最大值出现在72h的肠中，含量为6220ng/mL。从整个过程来看，感染前期（0~36h）病毒在这些组织内快速增殖；感染中期（36~72h）病毒在这些组织内增殖速度明显减慢；感染后期（72h以后）病毒含量平稳，克氏原螯虾开始大量死亡。整个感染过程，WSSV敏感组织（血淋巴、肠、性腺）的病毒含量明显高于非敏感组织（鳃、心脏、肌肉、肝胰腺）的病毒含量。
　　综上所述，本文在精提WSSV、制备兔抗WSSV血清、制备并纯化了WSSV单抗腹水的基础上，应用双抗体夹心ELISA建立了定量测定WSSV蛋白浓度的方法，这为实验室检测和定量分析WSSV提供了可靠的方法和依据，对于WSSV定量检测提供一种新的途径，具有重要的意义。

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0.1对虾白斑综合征病毒概述

0.2 对虾白斑综合征病毒检测技术的研究进展

0.3 双抗体夹心ELISA的研究进展

1 兔抗WSSV血清的生产

1.1 抗原的生产

1.2 兔抗WSSV血清的生产

2 WSSV单克隆抗体的生产

2.1 WSSV单克隆抗体类型的鉴定

2.2 抗WSSV单克隆抗体的体内生产

3 双抗体夹心ELISA检测WSSV标准曲线的建立

3.1 兔抗WSSV血清和单抗的效价测定

3.2 双抗夹心ELISA最适条件的确定

3.3 双抗体夹心ELISA标准曲线的建立

3.4克氏原螯虾人工感染WSSV后各组织内病毒含量变化

参考文献

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