Bacillus amyloliquefaciens M1菌株生产的抗菌脂肽对耐药性海洋病原弧菌抑菌活性的研究

摘要

解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)在其生长过程中能产生多种脂肽类物质,具有显著的抗细菌、抗真菌和抗支原体活性。抗菌脂肽是由脂肪酸链和肽链两部分构成,兼具亲水性和疏水性,这类物质种类多样,结构各异。抗菌脂肽在农业生物防治、医药和环境治理等多个领域内具有巨大的应用潜力。抗菌脂肽具有广泛的抑菌活性,但是否对海洋病原弧菌有抑制作用呢?海洋动物弧菌病会对海水养殖造成重大的经济损失。目前主要通过使用抗生素来防治海洋动物弧菌性疾病,但抗生素容易使海洋环境中的微生物产生耐药性,破坏海洋菌群的平衡。所以亟需寻找一种能杀死耐药性病原弧菌的,天然且安全的抑菌物质来防治海洋动物的弧菌性疾病。
　　本研究中,M1菌株是一株分离自红树林的菌株,其次级代谢产物具有较强的抑菌活性。利用常规方法和分子生物学方法对M1菌株进行鉴定,该菌株被鉴定为解淀粉芽孢杆菌(B. amyloliquefaciens),这是一株在实际应用中比较安全的细菌。M1菌株可以对9种常见的具有耐药性的海洋病原弧菌产生抑菌活力。
　　为了降低M1菌株产抑菌物质的生产成本,利用廉价原料优化了发酵培养基。最佳发酵条件为:豆饼粉1.0％(w/v),面粉1.5%(w/v),pH7.0,培养温度为28℃,180 rpm振荡培养24 h。完成了M1菌株在10-L发酵罐中的发酵实验,M1菌株在发酵培养21 h时进入生长稳定期,菌体量达到1.6×109 cells/mL,在第18 h时抑菌活力最大,抑菌圈直径为34.0 mm、并测定了淀粉酶活力(最高为48.7 U/mL)和蛋白酶活力(最高为2.3 U/mL)随时间变化规律。通过酸沉淀、甲醇抽提,薄层层析和高效液相色谱法(HPLC)等手段对发酵上清液中的抑菌物质进行了分离和纯化,获得了抑菌物质NQ。质谱分析表明,抑菌物质NQ是表面活性素(surfactin),由Glu-Leu-Leu-Val-Asp-Leu-Leu分别连接C12、C13、C14和C15的β-羟基脂肪酸构成的环状脂肽。纯化后的抗菌脂肽NQ最适作用温度是28℃,在20℃-40℃之间都有良好的稳定性;在pH7.0-9.0之间抗菌脂肽的稳定性较好,其最小抑菌浓度为12.5μg/mL。
　　对M1菌株纯化后的抗菌脂肽的抑菌机理进行初步探究:纯化后的抗菌脂肽不仅可以杀死完整的鳗弧菌细胞,还能杀死鳗弧菌细胞的原生质体,这说明抗菌脂肽可能是通过破坏细胞膜来杀死细菌的。电镜检测发现,被抗菌脂肽作用过的鳗弧菌细胞表面出现破损,细胞出现降解,细胞内容物释放,导致细胞死亡,说明抗菌脂肽能破坏鳗弧菌细胞表面结构。荧光检测发现抗菌脂肽作用过的鳗弧菌细胞可以被染料PI染色,进一步证明抗菌脂肽能破坏细胞膜结构,改变细胞通透性,破坏细胞的完整性,进而杀死整个细胞。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

第一章 绪论

1.1 前言

1.2 抗菌脂肽的研究进展

1.3 抗菌脂肽的种类、结构及功能

1.4 抗菌脂肽的发酵生产

1.5 抗菌脂肽的提取与纯化

1.6 抗菌脂肽的应用及发展前景

1.7 本研究的目的及意义

第二章 产抑菌活性物质的M1菌株的鉴定

2.1 前言

2.2 实验材料

2.3 实验方法

2.4 结果与讨论

2.5 本章小结

第三章 M1菌株产抑菌物质发酵条件的优化及发酵试验

3.1 前言

3.2 实验材料

3.3 实验方法

3.4 结果与讨论

3.5 本章小结

第四章 抑菌物质的分离纯化

4.1前言

4.2 实验材料

4.3 实验方法

4.4 结果与讨论

4.5 本章小结

第五章 M1菌株抗菌脂肽抑菌机理的初步研究

5.1 前言

5.2 实验材料

5.3 实验方法

5.4 结果与讨论

5.5 本章小结

论文的总结与创新点

参考文献

附录：英文缩写符号及其中英文名称

致谢

个人简历

硕士期间发表的学术论文