发光细菌双酶体外发光体系在快速检测中的应用研究

摘要

发光细菌双酶体外发光体系已经建立并且应用于 NADH的快速检测中。本文以鳆发光杆菌YL为研究对象,通过不同的酶促反应将NADH与其特定底物相关联,建立了双酶发光体系快速检测乙醇和丙酮酸含量的方法,并探究了葡萄糖及其衍生物葡萄糖-6-磷酸含量与双酶发光体系发光强度的关系。新方法能够兼顾传统酶法检测反应条件温和、反应快速、高度专一的优点以及现场操作、快速检测的要求,为今后开发新型便携式快速检测仪器提供了理论基础。
　　1、通过乙醇脱氢酶使乙醇还原NAD+为NADH,建立了双酶发光体系快速检测乙醇含量的方法。通过测定NADH在双酶体系中的发光强度,来确定样品中乙醇的含量。方法的线性范围为0.002 mol/L-0.1 mol/L,检测限为1.36×10-4 mol/L。用本法测定了其他醇类如甲醇等,其发光强度很低或反应速度明显变慢,均不影响对乙醇的检测。应用本法测定了啤酒样品中的乙醇含量,并进行了加标回收实验,其重复性和精密度良好。
　　2、通过乳酸脱氢酶使乳酸氧化NADH为NAD+,建立了双酶发光体系快速检测丙酮酸含量的方法。通过测定反应前后 NADH在双酶体系中发光强度的差值,来确定样品中丙酮酸的含量。方法的线性范围为0.00014 mol/L-0.001 mol/L,检测限为8.537×10-5 mol/L,特异性良好。应用双酶发光体系法测定了鹌鹑血清中的丙酮酸含量,并进行了加标回收实验,其灵敏度好,精密度高。
　　3、通过己糖激酶使葡萄糖转化为葡萄糖-6-磷酸,后者在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的催化作用下将NADP+还原为NADPH,通过测定NADPH在双酶体系中的发光强度,来探究葡萄糖及其衍生物葡萄糖-6-磷酸含量与发光强度的关系。与紫外分光光度计法相比,通过双酶发光体系检测葡萄糖的线性范围降低了两个数量级,而且线性关系更好。探究了葡萄糖-6-磷酸含量与双酶发光体系发光强度的关系,其检测限低至6.468×10-7 mol/L。这为今后建立双酶发光体系快速检测葡萄糖及葡萄糖-6-磷酸含量的方法奠定了基础。

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0前言

0.1发光细菌简介

0.2 发光细菌双酶体外发光体系简介

0.3乙醇的定量分析方法概述

0.4丙酮酸的定量分析方法概述

0.5葡萄糖的定量分析方法概述

0.6 研究目的与意义

1发光细菌双酶发光体系快速检测乙醇方法的建立

1.1引言

1.2实验材料与仪器

1.3实验方法

1.4实验结果与讨论

1.5小结

2发光细菌双酶发光体系快速检测丙酮酸方法的建立

2.1引言

2.2实验材料与仪器

2.3实验方法

2.4实验结果与讨论

2.5小结

3 葡萄糖及其衍生物葡萄糖-6-磷酸含量与双酶发光体系发光强度的关系探究

3.1引言

3.2实验材料与仪器

3.3实验方法

3.4实验结果与讨论

3.5小结

4论文总结

5论文的创新性

6后期工作展望

参考文献

附录

致谢

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