壳寡糖对大肠杆菌细胞内生物分子动态变化的影响

摘要

壳聚糖是甲壳素脱乙酰基的产物,由2-氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖聚合构成,生物学功能丰富,已有研究表明壳聚糖及其降解产物壳寡糖可以有效地抑制大肠杆菌的生长,且具有无毒、易降解、生物相容性等优点,应用前景广阔。目前,关于壳聚糖及壳寡糖对微生物的抑制规律已有大量的研究报道,其中包括壳聚糖会破坏微生物的细胞膜的渗透性,会引起微生物胞内活性氧的含量增加等,但关于其抑菌机理方面的认识不足。本论文采用生物化学分析和蛋白质组学的方法,开展了壳寡糖在抑制大肠杆菌生长过程中引起的生物分子动态变化的研究,结果如下。
　　利用平板计数法测定壳寡糖处理对大肠杆菌生长的抑制效果,结果表明在0.5％壳寡糖的作用下,活菌数表现为先减少后增多,而1%壳寡糖的处理使活菌数逐渐减少,抑菌效果明显。通过检测胞内碱性磷酸酶、乳酸脱氢酶和β-半乳糖苷酶的外泄情况得出在0.5%和1%壳寡糖的作用下,大肠杆菌的菌体完整性遭到了一定程度的破坏。应用流式细胞术检测了大肠杆菌的凋亡情况:大肠杆菌在培养2h、4h和6h的情况下,细胞凋亡程度逐渐增强,而坏死程度基本稳定。综合分析大肠杆菌凋亡实验结果、活菌数结果及菌体完整性的实验结果,表明大肠杆菌的生长在受到壳寡糖影响时表现为坏死程度相对稳定而凋亡程度不断增加,说明壳寡糖可能主要是通过诱导大肠杆菌发生凋亡来发挥抑菌作用的。
　　大肠杆菌在0.5%和1%壳寡糖的处理下,胞内活性氧浓度快速升高,随后逐渐降低,1%壳寡糖处理组变化趋势较0.5%壳寡糖处理组明显,而且在相同的时间下1%壳寡糖处理组活性氧的相对含量高于0.5%壳寡糖处理组。在氧化性损伤的测定中,在0.5%和1%壳寡糖的处理下,膜质的氧化损伤,蛋白质的氧化损伤严重,丙二醛含量、蛋白质羰基化和硝基化含量明显高于对照组,0.5%壳寡糖处理的大肠杆菌在0-4 h内丙二醛含量、蛋白质羰基化和硝基化含量逐渐增加,而在4-16 h其含量逐渐减少。1%壳寡糖处理的大肠杆菌随着时间的延长膜质和蛋白质氧化损伤逐渐增强。而DNA氧化损伤,在0.5%和1%壳寡糖的处理下,8-羟基脱氧鸟苷的含量在2h和4h与对照组有明显差异外,在其他时间内DNA氧化损伤作用不明显。上述结果表明壳寡糖处理可能通过诱导胞内活性氧浓度增加和积累进而导致生物分子的氧化损伤,影响大肠杆菌的生长。
　　利用蛋白质组学技术检测了壳寡糖处理后大肠杆菌胞内蛋白质表达的差异情况。大肠杆菌在0.5%和1%壳寡糖处理下培养4 h,提取的大肠杆菌总蛋白经双向电泳分离,综合处理组与对照组蛋白点的差异与不同,共分离得到1150个蛋白点,对蛋白质的2-D电泳图谱进行比对分析,选择2倍差异变化的蛋白点作为分析对象,结合胶上蛋白点的实际情况对其中的42个蛋白点进行质谱分析鉴定,成功鉴定出40个蛋白点,这些蛋白点属于35种蛋白质,壳寡糖处理组与对照组相比有28个蛋白点表达量上调,有10个蛋白点表达量下调,有2个特殊点在0.5%壳寡糖处理组与1%壳寡糖处理组和对照组之间呈现不同。为了进一步了解差异表达蛋白的功能,鉴定得到的蛋白质进行功能聚类分析,结果表明上述蛋白主要参与物质代谢、蛋白质合成和氧化还原等。其中,壳寡糖处理组与对照组相比,与氧化还原相关的蛋白质全部上调,物质代谢相关蛋白质和蛋白质合成相关蛋白大部分上调。
　　本实验研究了壳寡糖对大肠杆菌细胞内生物分子的动态变化影响,结果表明壳寡糖诱导了大肠杆菌胞内活性氧的增加和积累,引起了细胞凋亡和氧化损伤,参与大肠杆菌物质代谢和蛋白质合成等相关蛋白质的表达也发生了变化,引起了代谢紊乱,这些可能是壳寡糖抑制大肠杆菌生长的方式。

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0 前言

0.1 壳寡糖介绍

0.2 活性氧

0.3 蛋白质组学

0.4 立题背景、研究内容及研究意义

1 壳寡糖对大肠杆菌的抑制作用研究

1.1 试剂与仪器

1.2 方法与步骤

1.3 结果与讨论

1.4 本章小结

2 壳寡糖诱导大肠杆菌的氧化损伤研究

2.1 试剂与仪器

2.2 方法与步骤

2.3 结果与讨论

2.4 本章小结

3 壳寡糖处理大肠杆菌的蛋白质组学研究

3.1 试剂与仪器

3.2 方法与步骤

3.3 结果与讨论

3.4 本章小结

4 全文结论与展望

5 论文的创新点

参考文献

（本文所用的缩写词）

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