大菱鲆髓样分化因子88(MyD88)及干扰素刺激基因15(ISG15)的克隆及其免疫应答表达模式的研究

摘要

大菱鲆(Scophthatmus maximus)是我国北方海域的重要经济养殖鱼类品种,自引进以来其养殖规模不断增长,一旦受到疾病的侵染就会造成大规模鱼类的死亡,给大菱鲆养殖业造成严重的危害。髓样分化因子88(myeloid differentiation factor88,MyD88)是Toll样受体信号途径中的重要转导蛋白,在Toll样受体信号识别病原体启动病原相关分子模式中发挥着重要的作用。在病原体侵染宿主细胞后,细胞特异性受体能够特异性识别病原体,激活下游JAK-STAT信号转导途径产生细胞因子、趋化因子和干扰素并进一步激活下游的干扰素刺激基因(Interferon stimulated genes,ISGs),而ISG15就是ISGs其中的一员。ISG15能够通过直接与病毒蛋白相互作用,使其失去活性而发挥抗病毒作用,同时它作为一种重要的调节因子参与多种生理与免疫反应过程。因此,对于大菱鲆MyD88和ISG15的研究将会给大菱鲆抗病育种工作提供一定的理论基础。
　　本文以大菱鲆为研究对象,采用同源克隆及RACE技术,分别从大菱鲆的头肾组织中克隆得到大菱鲆MyD88基因的全长cDNA、ISG15的全长cDNA和基因组DNA。大菱鲆MyD88的cDNA全长为1619 bp,包含开放性阅读框为855 bp,可以编码285个氨基酸。SmMyD88同其他脊椎动物的MyD88一样具有一个死亡结构域(Death domain,DD)和一个TIR结构域。在TIR结构域中还含有三个高度保守的结构:Box1、Box2和Box3。大菱鲆ISG15全长cDNA长803 bp,其中ORF为474 bp编码158个氨基酸。SmISG15同其他物种的ISG15一样,包含两个类泛素结构域(Ubiquitn-like domain,UBL domain),在类泛素样结构域中分别有六个疏水中心,在C末端含有一个保守的RLRGG基序。大菱鲆ISG15的基因序列长为862 bp,是由两个外显子和一个内含子组成,其中内含子位于其5’非翻译区中。
　　我们采用Real-time PCR的方法,分别检测了在健康鱼体内12个组织(包括脑、鳃、胃、肠、心脏、头肾、体肾、肝、脾、性腺、肌肉、皮肤)中SmMyD88和SmISG15的表达情况。MyD88和ISG15在大菱鲆这12个组织呈组成型表达,且SmMyD88和SmISG15均在头肾、体肾、脾等免疫相关组织中的表达量较高,说明MyD88和ISG15在大菱鲆在免疫系统中发挥着作用。
　　本研究采用了实时定量PCR的方法研究了大菱鲆MyD88和ISG15的免疫应答模式。表达分析的结果表明,MyD88在受到LPS,CpG-ODN2395和TRBIV刺激后均呈上调表达,其中在受到CpG-ODN2395刺激的诱导表达量最强。而在受到刺激后,免疫相关组织的诱导表达量较肌肉高且峰值出现的时间较早。这些结果为MyD88介导不同的病原识别途径发挥作用提供可能。大菱鲆ISG15基因在受到poly I:C和TRBIV刺激后,在鳃、脾、头肾和肌肉中均检测到了上调表达,并且能检测到两个峰值。结果表明在免疫组织中的诱导表达量较非免疫组织中高。这些结果为ISG15的抗病毒作用提供了可能性并且为其在抗病毒免疫中的发挥作用的途径提供了证据。
　　实验结果为深入研究大菱鲆MyD88依赖的Toll样受体的信号转导途径和ISGs的抗病毒作用途径奠定了基础,并为有效开展大菱鲆疾病的免疫防控工作提供了理论支持。

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第一章 前言

1.1 机体的免疫反应

1.2 先天免疫系统

1.3 鱼类的先天免疫反应

1.4 鱼类中Toll样受体的信号传导途径

1.5 髓样分化因子88（MyD88）

1.6 干扰素刺激基因

1.7 干扰素刺激基因15（ISG15）

1.8 本研究的意义

第二章 大菱鲆MyD88和ISG15 cDNA的克隆和序列分析

2.1 实验材料

2.2实验方法

2.3 实验结果及分析

2.4 讨论

第三章 大菱鲆MyD88和ISG15 mRNAs的组织分布研究

3.1实验材料

3.2实验方法

3.3结果分析

3.4讨论

第四章 大菱鲆ISG15和MyD88基因的表达分析

4.1实验材料

4.2 实验方法

4.3 结果分析

4.4 讨论

结论

参考文献

致谢

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