大菱鲆干扰素调节因子3(IRF-3)和干扰素调节因子7(IRF-7)基因克隆与表达分析

摘要

大菱鲆(Scophthalmus maximus)是我国北方一种重要的海水养殖鱼类品种。近年来,随着人工养殖规模的迅速扩大,病害问题日益严重,尤其是病毒性疾病如大菱鲆红体病给我国大菱鲆养殖业带来了较大的经济损失。作为多功能转录因子,干扰素调节因子(Interferon regulatory factors,IRFs),特别是IRF-3和IRF-7,在干扰素(Interferon,IFN)的转录调控、病原体的免疫反应等方面起到非常重要的作用。因此,对大菱鲆干扰素系统的深入研究在大菱鲆病毒性疾病的防治上具有重要的理论和现实意义。目前,大菱鲆IRF-3(SmIRF-3)和IRF-7(SmIRF-7)尚未被克隆和研究。
　　 本文采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、同源PCR克隆(HomologyPCR Cloning)和cDNA末端快速扩增(Rapid Amplification of cDNA ends,RACE)技术,从大菱鲆头肾组织中获得IRF-3和IRF-7基因的全长cDNA和基因组DNA。大菱鲆IRF-3 cDNA(GenBank登录号:HQ424131)全长为2820bp,完整开放阅读框长1398bp,编码466个氨基酸,5’非翻译区长242bp,3’非翻译区长1180bp。IRF-3基因组DNA全长bp,包括11个外显子和10个内含子。大菱鲆IRF-7基因cDNA(GenBank登录号:HQ424129)全长为1976bp,完整开放阅读框长1308bp,编码436个氨基酸,5’非翻译区长13bp,3’非翻译区长646bp。IRF-7基因组DNA(GenBank登录号:HQ424130)全长3999bp,包括10个外显子和9个内含子。同其他鱼类IRF-3和IRF-7编码的氨基酸类似,大菱鲆IRF-3和IRF-7编码的氨基酸序列也具有典型的DNA结合域(DNA binding domain,DBD)、IRF相关域(IRF association domain,IAD)和丝氨酸富含域(Serine-rich domain,SRD)。与其他脊椎动物的IRF-3和IRF-7氨基酸序列比对发现,大菱鲆IRF-3和IRF-7与它们具有较高的同源性。系统进化分析表明大菱鲆IRF-3和IRF-7属于IRF-3亚家族的两个不同成员,它们可能来自共同的祖先基因。
　　 采用RT-PCR方法对IRE-3和IRF-7这两个基因在健康大菱鲆脑、鳃、胃、肠、心、头肾、体肾、肝、脾、性腺、肌肉和皮肤12个组织中表达分布情况进行了研究。实验结果表明,IRF-3基因在头肾、体肾和脾中表达水平较高,中等程度表达于鳃和肠,在胃、心、肝中表达较弱,而在脑、性腺、肌肉和皮肤中几乎没有表达。大菱鲆IRF-7基因在所研究的组织中均有较明显的表达。其中,高水平表达于脑、胃、肠、心、头肾、体肾、脾和性腺中,中等程度表达于鳃、肝、肌肉和皮肤中。
　　 为了解大菱鲆IRF-3和IRF-7基因的表达规律及其在干扰素信号系统中的地位与作用,实验在不同的时间点用大菱鲆红体病毒(TRBIV)感染健康的大菱鲆,并检测感染0、1、2、3、4、5、7天后SmIRF-3、SmIRF-7和Mx三个基因在头肾、脾、鳃和肌肉组织中的表达情况。研究结果发现,经TRBIV感染的大菱鲆头肾和肌肉组织中,IRF-3、IRF-7和Mx三个基因均上调表达。在头肾中,SmIRF-3、SmIRF-7和Mx表达峰值分别出现在病毒感染后的第一天、第二天和第四天,表达量是对照水平的10倍、12倍和6倍。在脾中,SmIRF-3和Mx表达峰值均出现在病毒感染后的第一天,表达量是对照水平的16倍和4.7倍。在鳃中,SmIRF-3和Mx表达峰值分别出现在病毒感染后的第二天和第四天,表达量是对照水平的3.7倍和2.8倍。在肌肉中,SmIRF-7和Mx表达峰值分别出现在病毒感染后的第二天和第五天,表达量是对照水平的4.5倍和2.8倍,这些结果呈现出一定规律性,表明IRF-3和IRF-7在鱼类抗病毒反应中起着重要的作用。
　　 本文成功克隆到大菱鲆IRF-3和7的全长cDNA序列和基因组序列,并对其表达情况进行相关的分析,了解了IRF-3、IRF-7及Mx基因的联动表达规律,为深入研究鱼类干扰素系统的信号转导途径、有效开展大菱鲆病毒性疾病的免疫防治等工作创造了条件。