羰基化对刀额新对虾原肌球蛋白结构的影响及修饰位点的鉴定

摘要

随着现代社会不断的发展，人类的饮食结构发生了巨大的改变，与食物直接相关的过敏疾病发病率也在逐年增高，给人们的生命健康造成了巨大威胁。虾类产品属于我国产值比较高的甲壳类海产品，由于营养丰富、味道鲜美，深受消费者的喜爱。然而随着虾类水产品越来越广泛的应用到食品工业中，使许多消费者饱受过敏症状的困扰。本论文着重对刀额新对虾过敏原原肌球蛋白的结构进行全面研究。探讨羰基化对其结构变化及修饰位点的影响，从机理角度进行深入的解析，为过敏原性质的改变提供理论指导。主要内容如下:
　　1、为了探究虾类在贮藏过程中过敏原结构的变化情况，本文以刀额新对虾为研究对象，采用不饱和脂肪酸的过氧化产物---丙二醛(MDA)对虾过敏原（原肌球蛋白）进行氧化，检测结构变化的规律。结果显示原肌球蛋白经过氧化后，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)观察到原肌球蛋白发生交联出现2、3、4、5倍的分子重量的4新条带。原肌球蛋白氧化前的峰值为88.80℃，氧化后的峰值为86.14℃，氧化后原肌球蛋白热稳定性变化不大。圆二色谱检测到α-螺旋的含量降低13.5％，有新的化学键形成，氧化后伴随着二，三级结构的破坏。红外光谱检测到在3010.06cm-1处有吸收峰表明有烯烃的存在，说明MDA能与氧化原肌球蛋白中的某些氨基酸的活性侧链相结合，形成新的羰基以及使其他功能发生过改变。虾原肌球蛋白由284个氨基酸组成，LC-MS-MS对氨基酸的氧化位点进行鉴定，检测到4个赖氨酸（76，168，189和233）、5个谷酰胺(61，70，118，147和247)、4个天冬酰胺（17，107，203和215）被氧化修饰。在数据库检测中发现部分氨基酸易被丙二醛氧化修饰外，其中蛋氨酸易被活性氧氧化，使原肌球蛋白的结构发生变化。
　　2、不饱和脂肪酸的另一种过氧化产物—4-羟基壬烯醛(HNE)对虾原肌球蛋白进行氧化，聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)观察到原肌球蛋白氧化前后基本呈现相似的条带，说明HNE氧化修饰后原肌球蛋白不发生交联，可能的原因是HNE包含一个活性醛基，而之前提到的MDA发生交联可能原因是MDA含有两个活性醛基。氧化吸收后原肌球蛋白的紫外吸收强度增加，发生轻微的蓝移，肽键可能被破坏使一级结构发生变化。原肌球蛋白氧化前的峰值为88.80℃，氧化后的峰值为59.99℃，热稳定性发生明显的改变，氧化后的原肌球蛋白发生明显的变性，构象型结构发生改变。圆二色谱检测到α-螺旋的含量降低2.5％，原肌球蛋白范德华力被破坏，伴随着二，三级结构的改变。氧化前后进行核磁分析，氨基化合物和甲基均发生了变化。通过LC-MS-MS对氨基酸的氧化位点进行鉴定，检测到5个丙氨酸（36，77，81，86和242）、9个亮氨酸(53，57，78，88，94，95，99，113和169)、3个赖氨酸（38，48和66）和1个组氨酸(44)被氧化修饰。相同地，在数据库检测中发现部分氨基酸易被HNE氧化修饰外，其中蛋氨酸易被活性氧氧化，氧化会使原肌球蛋白的结构发生变化。
　　3、虾类加工过程能够对虾类的过敏原结构和性质产生影响，从而改变其致敏活性。本实验选取核糖与虾过敏原进行糖基化反应。SDS-PAGE结果表明美拉德反应使虾过敏原分子量增高。原肌球蛋白氧化前的峰值为88.80℃，氧化后的峰值为35.71℃，热稳定性也发生明显的改变。圆二色谱检测到α-螺旋的含量降低1.4％，核糖与原肌球蛋白结合范德华力被破坏，伴随着二，三级结构的改变。通过LC-MS-MS对氨基酸的氧化位点进行鉴定，检测到1个苯丙氨酸(278)、3个异亮氨酸（69，92和190）、5个核糖修饰的蛋氨酸（11，50，126，141和171）和5个活性氧修饰的蛋氨酸（19，50，126，141和171）被氧化修饰。在数据库检测中发现部分氨基酸易被核糖氧化修饰，其中蛋氨酸也易被活性氧修饰，氧化会使原肌球蛋白的结构发生变化。
　　实验结果表明，羰基化修饰能诱导过敏原蛋白质的结构变化，对氨基酸位点修饰。蛋白质构象的变化以及位点的修饰，如暴露或掩埋进分子内部的氨基酸，均可以解释过敏原抗原性改变的原因。这些研究有助于对虾类过敏原的认识和控制，对于开发和生产低过敏性或无过敏性水产类食品，保障消费者食用安全等具有积极的意义。

目录

声明

摘要

0 前言

0．1 食物过敏原及性质

0．1．1 过敏食物种类

0．1．2 食物过敏现象及反应机理

0．1．3 食物过敏原的特性

0．1．4 食物过敏原的检测

0．1．5 食物过敏原活性的降低

0．2 水产食物过敏原

0．2．1 水产品过敏原种类

0．2．2 虾类过敏原研究进展

0．3 虾过敏原羰基化修饰

0．3．1 脂质过氧化物化学修饰

0．3．2 美拉德反应的糖基化修饰

0．4 研究的目的及意义

0．5 研究内容与技术路线

0．5．1 研究内容

0．5．2 技术路线

1 丙二醛对虾原肌球蛋白氧化修饰的鉴定

1．1 引言

1．2 仪器与试剂

1．2．1 实验仪器

1．2．2 主要材料与试剂

1．2．3 溶液的配制

1．3 实验方法

1．3．1 虾原肌球蛋白的提取

1．3．2 丙二醛的制备及反应

1．3．3 丙二醛氧化虾原肌球蛋白的电泳分析

1．3．4 原肌球蛋白氧化前后热性能的分析

1．3．5 原肌球蛋白氧化前后二级结构的分析

1．3．6 红外光谱的分析

1．3．7 氧化位点的分析

1．4 结果与讨论

1．4．1 丙二醛氧化原肌球蛋白组分的影响

1．4．2 丙二醛对原肌球蛋白的结构修饰

1．4．3 丙二醛氧化位点的鉴定

1．5 结论

2 4-羟基壬烯醛(HNE)对虾原肌球蛋白氧化修饰的鉴定

2．1 引言

2．2 仪器与试剂

2．2．1 实验仪器

2．2．2 主要材料与试剂

2．2．3 溶液的配制

2．4 实验方法

2．4．1 虾原肌球蛋白的提取

2．4．2 HNE和原肌球蛋白的反应

2．4．3 HNE氧化原肌球蛋白的电泳分析

2．4．4 紫外吸收光谱的分析

2．3．5 原肌球蛋白氧化前后热性能的分析

2．3．6 原肌球蛋白氧化前后二级结构的分析

2．3．7 氧化位点的分析

2．4 实验结果与讨论

2．4．1 HNE氧化原肌球蛋白组分的影响

2．4．2 紫外吸收光谱的分析

2．4．3 原肌球蛋白氧化前后热性能的分析

2．4．4 原肌球蛋白氧化前后二级结构的分析

2．4．5 原肌球蛋白氨基酸氧化位点的鉴定

2．5 结论

3 核糖对虾原肌球蛋白氧化修饰的鉴定

3．1 引言

3．2 仪器与试剂

3．2．1 实验仪器

3．2．2 主要材料与试剂

3．2．3 溶液的配制

3．4 实验方法

3．4．1 虾原肌球蛋白的提取

3．4．2 核糖和原肌球蛋白的反应

3．4．3 原肌球蛋白糖基化的电泳分析

3．3．4 原肌球蛋白氧化前后热性能的分析

3．3．5 原肌球蛋白氧化前后二级结构的分析

3．3．6 氧化位点的分析

3．4 实验结果与讨论

3．4．1 原肌球蛋白糖基化组分的影响

3．4．2 原肌球蛋白氧化前后热性能的分析

3．4．3 原肌球蛋白氧化前后二级结构的分析

3．4．4 核糖修饰原肌球蛋白氨基酸位点的鉴定

3．5 结论

4．论文总结

5．论文创新性

参考文献

致谢

个人简历

发表的学术论文