鱿鱼墨多糖在上皮细胞的跨膜转运及小鼠体内的消化吸收研究

摘要

鱿鱼墨是一种很有潜力的天然药物资源，在我国有着悠久的药用历史，但是在鱿鱼加工中，墨囊通常作为废弃物而丢弃。鱿鱼墨多糖近年来被证实具有多种生理活性，如提高免疫力、抗肿瘤、化疗保护、抗氧化、改善肠道粘膜免疫等。目前鱿鱼墨多糖相关研究多集中于其生物活性上，尚无鱿鱼墨多糖消化吸收方面的研究。本文主要目的是通过体内体外实验探讨鱿鱼墨多糖的消化吸收机制，有助于更有效地开发其生物活性，为鱿鱼墨多糖应用于食品、保健领域以及临床应用提供了一定的理论基础。本文主要研究工作如下:
　　1)鱿鱼墨多糖的提取及制备多糖抗体:处理北太平洋鱿鱼墨囊，提取纯化获得鱿鱼墨纯多糖SIP，将SIP与BSA偶联获得人工抗原，经动物免疫获得抗多糖血清，血清纯化后检测抗体浓度及其效价。结果显示经过酶法提取、乙醇沉淀和三氯乙酸除杂蛋白，冷冻干燥后粗多糖得率约为1.5％（m/v），多糖经离子交换色谱和凝胶渗透色谱分级纯化，多糖纯度达到95％以上。四只新西兰大白兔的血清抗体浓度分别为A兔2.506mg/mL、B兔2.942mg/mL、C兔2.602mg/mL、D兔2.605mg/mL，ELISA法检测效价筛选出最优抗体A兔抗为1∶3200。
　　2)利用鱿鱼墨多糖抗体研究多糖在肠上皮细胞的跨膜转运:利用鱿鱼墨多糖SIP孵育MDCK单层细胞后经多聚甲醛固定，结合免疫组化的方法利用多糖抗体追踪定位多糖。结果表明SIP(200μg/mL)孵育1h后激光共聚焦显微镜下在MDCK细胞内追踪到微弱的多糖信号。由于多糖信号不强而需要更为灵敏的方法进行研究，接下来的章节采用荧光标记法和色谱法结合来研究鱿鱼墨多糖的消化吸收。
　　3)鱿鱼墨多糖的荧光标记及其化学检测:利用荧光素FTSC通过酰胺反应对鱿鱼墨多糖SIP进行荧光标记并利用TLC法、UV法、3Dscan、HPLC法验证其化学特性。结果显示TLC法中SIP在原点处发荧光，无游离荧光素，表明SIP已经成功标记。荧光多糖SIP-FTSC与SIP相比，在410～530nm范围内产生了特征吸收峰，SIP-FTSC与FTSC的荧光特性类似，得到Ex=495nm Em=518nm，该特性通过HPLC中RID检测器和FLD检测器得到验证。最后对标记条件进行了优化，最终采用条件为荧光素含量FTSC∶SIP=0.06∶1，反应时间12h，催化试剂比值EDC∶NHS∶SIP=4∶4∶1。
　　4)利用荧光标记多糖研究多糖在肠上皮细胞的跨膜转运和体内吸收:SIP-FTSC孵育Caco-2三维细胞，对荧光多糖在三维细胞模型的跨膜转运进行定位追踪和定量研究，同时用SIP-FTSC灌胃小鼠，研究其体内消化吸收状态。结果显示在200μg/mL浓度下，15min能在极少数Caco-2细胞中追踪到SIP-FTSC荧光信号，并验证此时actin，ZO-1，E-cadherin为完好无损状态;BL侧SIP-FTSC含量极低，转运量、转运率和Papp均随时间的增长而增长，120min时转运量仅有1.921μg/cm2，转运率仅为1.06％，Papp为1.4394×10-6cm/s。小鼠灌胃SIP-FTSC后，能够在血清中检测到荧光信号，1h达到峰值;粪便中荧光信号远高于血清，FL-HPLC图显示荧光多糖被部分降解，且肠道损伤小鼠粪便SIP-FTSC含量高于正常小鼠（P＜0.05）。

目录

声明

摘要

前言

1 天然多糖的生物活性

1．1 多糖的抗肿瘤活性

1．2 多糖的免疫调节活性

1．3 多糖的抗病毒活性

1．4 多糖的抗氧化活性

1．5 多糖的降血糖活性

1．6 多糖的降血脂活性

1．7 多糖的其它活性

2 多糖吸收代谢的研究

2．1 多糖吸收代谢测定方法

2．2 多糖吸收代谢研究概况

3 乌贼墨多糖的研究概况

3．1 乌贼墨多糖的结构和活性

3．2 鱿鱼墨多糖前期研究进展

4 研究目的、研究内容及意义

第一章 免疫学方法研究鱿鱼墨多糖在上皮细胞的跨膜转运

第一节 鱿鱼墨多糖的提取、分离纯化

1．1 引言

1．2 材料和仪器

1．3 实验方法

1．4 实验结果与讨论

第二节 鱿鱼墨多糖抗体的制备

2．1 引言

2．2 材料和仪器

2．3 实验方法

2．4 实验结果与讨论

第三节 鱿鱼墨多糖在MDCK细胞中的跨膜转运研究

3．1 引言

3．2 材料和仪器

3．3 实验方法

3．4 实验结果与讨论

本章小结

第二章 荧光标记法研究鱿鱼墨多糖的消化吸收

第一节 鱿鱼墨多糖的荧光标记

1．1 引言

1．2 材料和仪器

1．3 实验方法

1．4 实验结果与讨论

第二节 荧光标记多糖在Caco-2细胞模型中的跨膜转运研究

2．1 引言

2．2 材料与仪器

2．3 实验方法

2．4 实验结果与讨论

第三节 荧光标记多糖在小鼠体内消化吸收的研究

3．1 引言

3．2 材料和仪器

3．3 实验方法

3．4 实验结果与讨论

本章小结

结论

1 总结

2 本文创新点

参考文献

致谢

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