裂壶藻蛋白源抗氧化肽的制备分离及稳定性研究

摘要

裂壶藻（S.limacinum），又名裂殖壶菌，是破囊壶菌科一类单细胞球形的海洋真菌类微藻。裂壶藻中油脂含量丰富，多不饱和脂肪酸(PUFA)含量高，我国卫生部已于2007年将其批准作为新资源食品以推广应用，目前主要被用来生产高纯度DHA（二十二碳六烯酸）的保健品、婴幼儿乳制品添加剂等产品。然而裂壶藻中还含有丰富的维生素和必需氨基酸等营养成分，如提取多不饱和脂肪酸后所产生的藻渣中蛋白质含量可高达40％以上，这些藻渣却大多被当成饲料或肥料处理，蛋白资源未得到充分开发与利用。
　　本文以工业化提取油脂后的裂壶藻渣为原料，利用复合蛋白酶与Alcalase2.4L蛋白酶复配酶解方式制备抗氧化肽，研究了温度、pH值、食品辅料、防腐剂、各种金属离子及模拟胃肠环境对裂壶藻渣酶解物抗氧化稳定性的影响，采用超滤、葡聚糖分子凝胶色谱法和反相高效液相色谱法分离纯化裂壶藻抗氧化肽，并最终借助电喷雾质谱ESI-MS/MS确定肽段序列结构。本研究将为工业提取藻油后藻渣废料的高值化利用提供新的思路和方法，并为裂壶藻产品开发提供理论依据和重要参考。
　　在复合酶解制备抗氧化产物时，以水解度、蛋白回收率及产物抗氧化活性为指标，确定最佳的复合酶解工艺。结果表明，在pH为7.5，水解温度为50℃，料水比为1∶12（w/w），加酶总量为0.5％(E/S，w/w)条件下，采用复合蛋白酶与Alcalase2.4 L复配方式(1∶1，w/w)酶解裂壶藻渣6h后的产物水解效果与抗氧化活性均优于其它单酶或复合酶解产物。在此条件下，酶解产物的水解度为11.15％，蛋白回收率为70.82％，羟自由基半抑制浓度IC50为1.656 mg/mL，还原力为1.417（浓度3 mg/mL），具有很好的抗氧化活性。
　　在探究裂壶藻渣酶解物抗氧化稳定性的过程中，以裂壶藻渣酶解物清除DPPH自由基能力及还原力活性为评价指标，先后探讨了温度、pH、食品辅料、防腐剂、金属离子及人工胃肠道模拟环境对其抗氧化活性的影响。结果表明，在30～100℃范围内的温度变化对裂壶藻渣酶解物的抗氧化活性影响不明显;在酸性环境中酶解产物可以较好地保持活性;蔗糖及NaC1对酶解物活性影响不显著，葡萄糖在2～10％浓度范围内随浓度提高影响渐增;防腐剂山梨酸钾对酶解产物活性的影响略强于苯甲酸钠;金属离子对样品活性的影响大小为:Zn2+＞ Cu2+＞K+＞Ca2+;体外模拟胃肠试验中，酶解产物经胃肠液处理后其活性保持率可达65％以上。试验结果表明裂壶藻渣酶解物具备较好的抗氧化活性及稳定性，具有一定实际生产应用价值。
　　在裂壶藻抗氧化肽的分离纯化过程中，以DPPH自由基清除率和还原力大小作为评价指标，先后利用超滤、葡聚糖凝胶柱层析色谱、反向高效液相色谱（RP-HPLC）等系列分离纯化技术，从裂壶藻渣酶解产物中分离纯化获得抗氧化活性肽，发现分子量＜5kDa的SH-4-I-D组分活性最强，DPPH自由基清除率为83.8％(0.5mg/mL)，还原力大小为0.937(1mg/mL)。最终借助电喷雾质谱ESI-MS/MS确定该肽段氨基酸一级结构序列为Pro-Tyr-Lys，分子量406Da。

目录

声明

摘要

0 前言

0．1 微藻制备可再生能源

0．1．1 产氢

0．1．2 产烃

0．1．3 制备生物柴油

0．2 微藻制备生物活性物质

0．2．1 多不饱和脂肪酸(PUFA)

0．2．2 活性多糖

0．2．3 活性肽

0．2．4 天然色素

0．3 微藻制备功能性饲料

0．4 裂壶藻生产应用现状

0．5 本课题研究背景及内容

0．5．1 研究背景

0．5．2 研究意义和内容

1 复合酶解裂壶藻制备抗氧化肽工艺研究

1．1 材料与方法

1．1．1 材料与仪器

1．1．2 实验方法

1．2 结果与分析

1．2．1 五种不同蛋白酶水解条件及效果比较分析

1．2．2 不同酶解时间水解效果比较分析

1．2．3 不同料水比水解效果比较分析

1．2．4 复合酶解的水解效果比较分析

1．3 结论

2 裂壶藻渣酶解物的抗氧化稳定性研究

2．1 材料与方法

2．1．1 材料与仪器

2．1．2 实验方法

2．2 结果与分析

2．2．1 酶解产物稳定性影响因素分析

2．2．2 酶解物体外模拟胃肠道消化系统稳定性分析

2．3 结论

3 裂壶藻抗氧化肽的分离纯化及序列鉴定

3．1 材料与方法

3．1．1 材料与仪器

3．1．2 实验方法

3．2 结果与分析

3．2．1 超滤分离及其产物抗氧化活性分析

3．2．2 凝胶柱层析分离及其产物抗氧化活性分析

3．2．3 反相高效液相色谱(RP-HPLC)分离及其产物抗氧化活性分析

3．2．4 裂壶藻抗氧化肽电喷雾质谱(ESI-MS／MS)结构鉴定

3．3 结论

总结

参考文献

论文的创新之处

展望

致谢

个人简历

发表的学术论文