基于传统纯培养及宏基因组文库方法研究海洋来源蛋白酶及微生物多样性

摘要

近年来，工业酶市场逐年增加，2011年其市场总值达35亿美元，且以每年6.1％的速度增长。蛋白酶作为最为重要的工业酶之一，占到了整个工业酶市场的65％，且广泛应用于食品、医药、洗涤、制革、化妆品等行业中。尽管已经有大量关于蛋白酶的研究和应用的报道，寻找新型的功能特殊的蛋白酶仍然十分重要，特别是针对海洋水产蛋白的处理，需要特殊的蛋白酶以形成口感风味等。
　　目前，由于微生物具有生长快速，稳定且产酶能力强等特点，蛋白酶主要来源于微生物的发酵。而海洋中蕴藏着巨大的微生物资源，这些资源没有得到有效的开发利用，是寻找新型生物资源的优良场所。本文以海洋微生物资源为主要研究对象，通过传统的微生物纯培养方法和宏基因组学的方法，研究海洋来源的蛋白酶资源。主要研究内容包括以下三个方面:
　　1)筛选南海沉积物中产蛋白酶微生物并对南海微生物多样性进行初步分析:共筛选了南海23个位点的产蛋白酶微生物共获得76株产蛋白酶微生物，其中有高温菌(50℃)27株，常温菌(28℃)34株，低温菌(10℃)15株。微生物16S鉴定显示已筛选的产酶菌株主要包含芽孢杆菌属、假单胞菌属、放线菌属等。
　　微生物多样性通过扩增16S V4区并测序分析，19个不同位点的南海样品，平均获得3587条有效片段，平均OTU聚类数为1492，说明该区域具有大量的微生物资源。在所有的微生物，主要为变形菌门和泉古菌门，其次为浮霉菌门和厚壁菌门等。同时，微生物群落的α-多样性和β-多样性分析也表明南海19个不同位点的微生物多样性具有较大的差异。
　　2)分离纯化了微球菌NH54PC02所产的碱性蛋白酶并研究了酶学性质及其在水产品上的应用:纯化的步骤共三步，包括:硫酸铵沉淀，DEAE-弱阴离子交换层析和苯基疏水层析，回收率为23.68％，纯化倍数为8.22倍，最终获得了电泳纯的蛋白酶，SDS-PAGE显示蛋白酶分子量约为25 kDa，质谱测序表明该蛋白酶属于蛋白酶S8家族（丝氨酸蛋白酶）。
　　对纯化后蛋白酶的酶学性质表征，蛋白酶NH54PC02在pH6-11的条件下均表现出酶活力，最适反应pH为pH10.0，且在pH7-11条件下酶活力较高，说明该蛋白酶是碱性蛋白酶。蛋白酶在不同pH条件下稳定性实验显示，该酶在碱性条件下十分稳定，在pH6时依然可以保留75％的酶活力。该酶的最适温度为50℃，在40℃和60℃时酶活力分别保留54％和96％，但当温度上升到70℃时，酶活力急剧下降，仅剩下30％的酶活力。但该酶在高温条件的热稳定性很差，在40℃保温1h可以保留90％以上的酶活力，但50℃保温1h后，基本丧失所有的酶活力，可见，该蛋白酶不适宜在高温条件下存储。
　　化学试剂对酶活力的影响实验中发现:高浓度的蛋白酶抑制剂PMSF和胃蛋白酶抑制剂对酶活抑制明显，低浓度的EDTA可以强烈的抑制酶活;在表面活性剂中，非离子表面活性剂对酶活影响微弱，而离子表面活性剂则对酶活有显著影响;有机试剂也一定程度抑制酶的活力;金属离子中Mn2+可以显著促进酶活力。
　　蛋白酶水解虾头，虾粉和鲲鱼蛋白结果显示，水解后，所有水产品的氨基态氮含量和多肽含量均增加，对虾粉水解前后的游离氨基酸含量进行测定，水解后，虾粉中出现了原本没有的游离氨基酸:色氨酸和鸟氨酸，且部分氨基酸含量显著增加，如天冬氨酸增加了三倍多，谷氨酸，亮氨酸，苯丙氨酸均增加近两倍。
　　3)构建海洋沉积物宏基因组文库，并从中筛选蛋白酶功能基因:先后研究了不同海洋来源的土壤样品。目前成功构建了4个海洋宏基因组文库，样品来源分别为长江口WO3样品，南海NH26和NH54样品以及来自印度尼西亚的海泥样品。从印尼Fosmid宏基因组文库中获得20000株克隆，通过功能驱动方法，用脱脂奶粉平板进行帅选，从中筛选到4株具有蛋白酶活性的克隆，分别命名为F1-1，F1-2，F2-1，F2-2（遗失），其他文库中没有筛到具有蛋白酶活性的克隆。
　　随后对上述的F1-1克隆构建亚克隆文库，用Sau3AⅠ对F1-1中的Fosmid质粒进行酶切，回收3-9 Kb的片段，再将其连接到用BamHⅠ处理的PBR322载体上，奶粉LB平板进行筛选。共获得8个阳性亚克隆。测序后获得一段3000bp的基因序列，利用软件预测开放阅读框，获得一段1254 bp的功能基因，NCBI序列比对和蛋白酶S8家族最相似，相似性为47％。说明该段基因的确为蛋白酶基因，且是一段全新的基因，具有较大的研究价值。

目录

声明

摘要

0 前言

0．1 蛋白酶

0．1．1 蛋白酶定义和分类

0．1．2 蛋白酶的工业应用

0．2 海洋微生物资源

0．2．1 海洋环境

0．2．2 海洋微生物资源

0．2．3 微生物资源的利用

0．3 宏基因组学

0．3．1 宏基因组学概述

0．3．2 宏基因组学的应用研究

0．4 本课题的立题背景、意义、研究内容和创新点

0．4．1 研究背景和意义

0．4．2 本课题的研究内容

0．4．3 本课题的创新点

1 南海海洋沉积物微生物多样性分析及可培养微生物产蛋白酶特性分析

1．1 引言

1．2 材料与方法

1．2．1 海洋沉积物样品

1．2．2 主要试剂、仪器

1．2．3 培养基

1．2．4 酶活测定方法

1．2．5 微生物生态分析

1．2．6 产蛋白酶菌株的筛选

1．2．7 可培养产蛋白酶酶微生物16S分析

1．1．8 菌株产酶活力分析

1．3 结果与讨论

1．3．1 南海微生物生态特性测定分析

1．3．2 产酶菌株的筛选

1．3．3 可培养产酶微生物特性分析

1．3．4 产酶特性分析

1．4 本章小结

2 海洋微球菌碱性蛋白酶的纯化和酶学性质研究

2．1 引言

2．2 材料与方法

2．2．1 微生物

2．2．2 试剂与仪器

2．2．3 微生物的筛选及鉴定

2．2．4 酶活测定

2．2．5 酪氨酸标准曲线的绘制

2．2．6 微球菌NH54PC02生长曲线和产酶曲线

2．2．7 蛋白酶的纯化

2．2．8 蛋白质谱分析

2．2．9 pH和温度对蛋白酶活性的影响

2．2．10 化学试剂对蛋白酶活性的影响

2．2．11 蛋白酶在水产品加工中的应用

2．3 结果与讨论

2．3．1 微球菌NH54PC02的筛选鉴定

2．3．2 微球菌NH54PC02的生长曲线和产酶曲线

2．3．3 蛋白酶的纯化

2．3．4 MALDI-TOF-TOF／MS质谱分析

2．3．5 温度和pH对蛋白酶活性的影响

2．3．6 化学试剂对蛋白酶活性的影响

2．3．7 蛋白酶在水产品上的应用

2．4 本章小结

3 海洋沉积物Fosmid宏基因组文库的构建及蛋白酶基因的筛选

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．2．1 海洋沉积物样品

3．2．2 主要试剂与仪器

3．2．3 海洋沉积物总DNA的提取和检测

3．2．4 Fosmid宏基因组文库构建

3．2．5 蛋白酶阳性克隆筛选

3．2．6 阳性克隆F1-1亚克隆文库的构建

3．2．7 亚克隆质粒测序及功能基因的预测分析

3．2．8 蛋白酶功能基因的克隆

3．2．9 蛋白酶功能基因的表达

3．3 结果与讨论

3．3．1 海洋沉积物总DNA的提取

3．3．2 Fosmid宏基因组文库的构建

3．3．3 蛋白酶阳性克隆的筛选

3．3．4 阳性克隆F1-1亚克隆文库的构建

3．3．5 亚克隆质粒测序及功能基因的预测分析

3．3．6 蛋白酶功能基因的克隆

3．3．7 蛋白酶功能基因的表达

3．4 本章小结

4 总结与展望

4．1 全文总结

4．2 研究展望

参考文献

致谢

个人简历