壳聚糖酶OU01底物结合与催化机理研究

摘要

壳寡糖是具有多种生物学功能的生物活性物质，在医药卫生、食品、农业等方面都具有广泛的研究及应用。在壳寡糖的制备方法中，以壳聚糖酶为基础的酶降解法具有专一性强，酶切效率高，反应条件温和，环保等优点，正受到越来越多的关注。迄今为止，已经从细菌、植物组织里发现了多种壳聚糖酶，对壳聚糖酶的基本性质、水解方式等都开展了研究。目前，已有三种壳聚糖酶单体的结构得到解析，为壳聚糖酶的研究提供了结构基础，但壳聚糖酶对底物的降解机制仍然不清楚。为此，本论文通过培养酶与底物复合物晶体，解析复合物的三维结构，从分子水平上对壳聚糖酶与底物的结合机理进行深入研究。本研究选取了酶活性较高的chitosanase OU01为研究对象，主要进行了以下几个方面的工作:
　　1、从菌株Microbacterium sp.的基因组中克隆了不含信号肽的chitosanase OU01基因。将基因与pGEX-6p-1相连，转化到E.coli BL21(DE3)中，构建了chitosanaseOU01的原核表达系统。通过IPTG诱导成功表达了重组蛋白。通过亲和层析、柱上酶切和凝胶过滤层析对重组蛋白进行了分离纯化，最终获得高纯度的chitosanase OU01，电泳结果显示其分子量在30 kDa左右。
　　2、利用TLC，质谱，NMR技术对chitosanase OU01的动力学参数、酶解产物、水解动力学进行了研究。基本动力学参数如下:Km为4.197 mg/ml，最大反应速率Vmax为0.049μmol/min，催化常数Kcat为12，297 min-1，比活力为476.6U/mg.protein;对脱乙酰度大于90％(DDA＞90％)壳聚糖进行充分水解后得到的产物主要为壳二糖和壳三糖;水解脱乙酰度大于99％(DDA＞99％)壳聚糖的整体水解过程表现出先快后慢的非均一性动力学过程。
　　3、参考序列比对，利用定点突变技术将两个氨基酸（Glu25与Asp43）分别突变成Ala，获得无催化活性的突变体，用于与壳六糖底物共混，进行复合物结晶。经过晶体生长条件的筛选与优化，获得了可用于X-射线衍射数据收集的复合物晶体。在此基础上，对复合物晶体结构进行了解析，首次获得了壳聚糖酶与底物的复合物晶体结构(PDBID:4OLT;4QWP)。
　　4、复合物结构的解析，进一步从结构角度确定了chitosanase OU01采用的是“inverting”催化机理，并首次阐明了催化关键氨基酸在催化反应中的作用。
　　5、通过复合物结构，首次揭示了chitosanase OU01结合口袋内部与每一个糖单元的相互作用。通过定点突变，进一步验证了chitosanase OU01结合口袋内部对底物结合起重要作用的氨基酸。
　　6、综合复合物结构、产物结构和分子对接分析，确定了-2位是chitosanase OU01中的底物特异性识别位点，该位点只能结合氨基葡萄糖，属于D-X-X（（-2）-(-1)-(+1))型底物特异性水解酶，该研究对chitosanase水解底物的特异性进行了重新定义。
　　7、通过表面电荷分析与突变体活性验证，寻找到了结合口袋之外对长链壳聚糖底物的结合起重要作用的氨基酸Asp40。
　　8、依据关键氨基酸残基对不同底物活性的影响及空间结构，对参与底物结合的关键氨基酸进行了分类，在此基础上，阐明了两类底物（寡糖底物和长链底物）与酶的复合物形成机理，并首次提出了长链底物与壳聚糖酶的“三步”结合原理。
　　9、通过复合物与文献报道的壳聚糖酶单体的结构比较，明确了“非连续”型壳聚糖酶在结构上的两个重要特征，一是结合口袋在水解过程中按照“开放-关闭-开放”的形式进行构象变化;二是参与底物结合的位点多为极性氨基酸，因此，酶与底物之间形成的相互作用主要是专一的氢键和静电作用。
　　本研究主要通过酶与底物的复合物晶体结构的解析，结合定点突变等生化技术，对chitosanase OU01的催化机理、酶切位点特异性、酶与底物复合物形成机理、“非连续”型壳聚糖酶结构特点等进行了研究，为壳聚糖酶的开发及应用提供了理论基础。

目录

声明

摘要

缩略语

第一章 文献综述

1 壳寡糖概述

1．1 壳寡糖的来源及功能

1．2 壳寡糖的制备

2 壳聚糖酶概述

2．1 壳聚糖酶的来源

2．2 壳聚糖酶的分类

2．3 壳聚糖酶基因的获得及体外异源表达系统构建

2．4 壳聚糖酶的性质

2．5 壳聚糖酶的生物学功能及应用

3 蛋白质X-射线晶体学概述

3．1 蛋白质结构的测定方法

3．2 蛋白质X-射线晶体学概述

4 壳聚糖酶的三维空间结构简介

5 GH46壳聚糖酶研究现状

5．1 壳聚糖酶的催化机理

5．2 壳聚糖酶水解过程及产物分析

5．3 壳聚糖酶中与催化相关的氨基酸功能研究

6 选题背景和研究意义

第二章 Chitosanase OU01在大肠杆菌中的重组表达及酶的分离纯化

第一节 Chitosanse OU01基因克隆及表达载体的构建

1 材料与试剂

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

5 小结

第二节 Chitosanse OU01在大肠杆菌中的表达及重组蛋白的分离纯化

1 材料试剂与主要仪器设备

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

5 小结

第三章 Chitosanase OU01动力学参数测定、酶解产物及酶动力学分析

1 实验试剂与主要仪器

2 实验方法

2．1 DNS标准曲线的制作

2．2 蛋白质浓度的测定

2．3 壳聚糖酶活力的测定

2．4 Chitosanase OU01动力学常数的测定

2．5 Chitosanase OU01水解产物分析

2．6 Chitosanase OU01水解动力学研究

3 实验结果

3．1 Chitosanase OU01的米氏常数

3．2 水解产物的质谱分析

3．3 水解产物的TLC分析结果

3．4 不同时间点水解样品的NMR分析

3．5 水解曲线

4 讨论

5 小结

第四章 Chitosanase OU01-(GlcN)6复合物晶体的培养与结构解析

1 实验试剂与主要仪器

2 实验方法

2．1 催化关键氨基酸的确定

2．2 关键氨基酸的定点突变

2．3 突变体蛋白的表达与分离纯化

2．4 突变体E25A与D43A活性测定

2．5 酶与底物复合物晶体的生长与筛选

2．6 晶体数据的收集

2．7 晶体结构解析

3 实验结果

3．1 催化关键氨基酸的确定

3．2 氨基酸定点突变

3．3 突变体活性

3．4 酶与底物复合物的形成

3．5 晶体生长条件筛选

3．6 复合物晶体衍射数据收集及结构解析

3．7 复合物晶体的整体结构描述

3．8 六糖底物的电子密度图

3．9 Chitosanase OU01空间结构比较

4 讨论

5 小结

第五章 基于复合物结构的底物结合特异性及催化机理研究

第一节 Chitosanase OU01结合口袋内部酶与底物的相互作用分析

1 实验试剂与主要仪器

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

5 小结

第二节 Chitosanase OU01的催化机理研究

1 实验方法

2 实验结果

3 讨论

4 小结

第三节 Chitosanase OU01酶切位点底物结合特异性分析

1 实验试剂

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

5 小结

第六章 壳聚糖酶与底物复合物的形成机理

1 实验方法

1．1 结合口袋外部底物结合位点预测

1．2 预测氨基酸功能的验证

1．3 突变体D40A的酶热稳定分析

1．4 小分子底物的制备及组分鉴定

1．5 突变体对小分子底物的活性测定

1．6 由底物结合引起的酶构象变化分析

2 实验结果

2．1 复合物结构表面电荷分析及底物结合位点预测

2．2 预测氨基酸突变体的相对酶活性

2．3 突变体D40A热稳定性分析

2．4 小分子底物的制备

2．5 突变体对小分子底物的相对活性

2．6 底物结合引起的酶构象变化分析

3 讨论

4 小结

全文总结

论文创新点

论文不足及下一步研究计划

参考文献

致谢

个人简历

发表的学术论文