喜盐草黄酮类化合物的提取、纯化及抗氧化活性研究

摘要

喜盐草（Halophila ovalis），多年浅海生沉水草本，属被子植物门，单子叶植物纲。隶属于沼生目((Helobiae)，水鳖科(Hydrocharitacea)，喜盐草属（HalophilaThou.）。喜盐草是海草床的重要组成部分。目前，国内尚未有关于喜盐草黄酮的报道，对喜盐草的研究主要集中在分类学、形态学和生理学等方面。
　　黄酮类化合物是一类自然界中广泛存在的化合物。研究表明，黄酮类化合物具有广泛的生物活性，包括抗氧化、抗衰老、抗突变、抗肿瘤、抗菌等。但是对于黄酮类化合物的研究一般只限于陆生高等植物，海洋中的高等植物尚并未被充分开发利用。
　　本文将海洋高等植物喜盐草作为研究对象，主要研究其黄酮类化合物的提取工艺、纯化方法，并研究了喜盐草黄酮的抗氧化活性，主要研究结果如下:
　　首先对喜盐草的基本成分进行了分析，发现喜盐草是一种蛋白含量高(11.66％)、低脂肪(1.16％)并且富含矿质元素(18.11％)的天然资源。在已测定的15中氨基酸中，必需氨基酸有7种，占氨基酸总量的34.70％。在必需氨基酸中，以缬氨酸含量最高，蛋氨酸含量最低。在非必需氨基酸中，谷氨酸含量最高，以组氨酸含量最低。呈味氨基酸丰富。
　　其次进行了黄酮类化合物的提取试验。以乙醇作为浸提液，研究了传统工艺浸提法、超声辅助提取法和纤维素酶辅助提取法，通过单因素实验和正交试验得出这三种提取方法对喜盐草黄酮类化合物的最佳提取条件，并对其最大得率进行比较。传统浸提工艺最佳提取条件:乙醇浓度为65％，提取温度为70℃，提取时间为4h，料液比为1∶40(g/mL)，喜盐草的黄酮类化合物得率为1.28％。超声辅助提取工艺的最佳提取条件:乙醇浓度为55％，超声功率为420W，超声时间为8min，喜盐草的黄酮类化合物得率为1.73％。纤维素酶辅助提取工艺的最佳提取条件:酶解温度60℃，酶解pH为5.5，酶解时间60min，酶用量为3％，喜盐草黄酮类化合物的得率为2.10％。结果表明，纤维素酶辅助提取工艺优于其他两种工艺。
　　利用有机溶剂萃取法得到了乙酸乙酯相和正丁醇相萃取物，后者黄酮纯度更高，且更符合黄酮的紫外吸收特征，所以作为分离纯化的主要研究对象。选择5种大孔吸附树脂，通过静态吸附和解吸实验，选定最优树脂AB-8;最后通过静态实验确定了最佳纯化工艺条件:样液pH为3，样液质量浓度为1.20mg/mL，吸附温度和解吸温度为25℃，洗脱液乙醇浓度为75％。在最佳纯化条件下，正丁醇相萃取物的黄酮类化合物纯度由原来的28.34％上升至47.28％，提高了1.7倍。经高效液相色谱法和电喷雾质谱鉴定，纯化后的喜盐草黄酮含有芹菜素-7-O-β-葡萄糖苷和柯伊利素-7-O-β-葡萄糖苷。
　　文章最后研究了喜盐草乙酸乙酯萃取物、正丁醇相萃取物、大孔树脂纯化物与芹菜素-7-O-β-葡萄糖苷和柯伊利素-7-O-β-葡萄糖苷的抗氧化活性，主要包括还原能力、清除羟基自由基能力、清除超氧阴离子自由基能力、清除DPPH自由基和亚硝基能力的测定。两种黄酮单体的还原力略低于VC，说明还原力接近于VC。在清除超氧阴离子自由基、DPPH自由基和亚硝基的能力方面，从高到低依次是VC、两种黄酮单体、大孔树脂纯化物、正丁醇相萃取物和乙酸乙酯相萃取物。两种黄酮单体清除羟基自由基的能力均大于VC和其他样品，说明两种黄酮单体具有较强的清除羟基自由基的能力。研究结果表明，喜盐草黄酮具有抗氧化活性，表现为具有一定的清除自由基和亚硝基的能力。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 喜盐草简介

1．1．1 海草的简介

1．1．2 喜盐草的分类地位、形态特征和分布

1．1．3 喜盐草的研究和利用现状

1．2 黄酮类化合物的研究现状

1．2．1 黄酮类化合物的结构和分类

1．2．2 黄酮类化合物的理化性质

1．3 黄酮类化合物的提取

1．3．1 溶剂提取法

1．3．2 超声波辅助浸提法

1．3．3 微波辅助浸提法

1．3．4 酶解法

1．3．5 超临界二氧化碳萃取

1．3．6 半仿生提取法

1．3．7 膜分离法

1．4 黄酮类化合物的分离纯化

1．4．1 大孔树脂吸附法

1．4．2 柱层析法

1．4．3 有机溶剂萃取法

1．4．4 高速逆流色谱(HSCCC)

1．5 黄酮类化合物的分析鉴定

1．5．1 紫外光谱(UV)

1．5．2 平面色谱法

1．5．3 高效液相色谱法(HPLC)

1．6 黄酮类化合物的生理活性

1．6．1 黄酮类化合物的抗氧化活性

1．6．2 黄酮类化合物的抑菌活性

1．6．3 黄酮类化合物的其他生理活性

1．7 本文的研究目的和研究内容

1．7．1 研究目的

1．7．2 研究内容

2 喜盐草的基本成分分析

2．1 实验材料与仪器

2．1．1 实验材料

2．1．2 实验仪器

2．2 实验方法

2．2．1 水分含量的测定

2．2．2 总糖含量的测定

2．2．3 蛋白质含量的测定

2．2．4 粗脂肪含量的测定

2．2．5 灰分含量的测定

2．2．6 氨基酸含量的测定

2．3 实验结果

2．4 讨论

3 喜盐草中黄酮类化合物的提取工艺研究

3．1 引言

3．2 实验材料与试剂

3．2．1 实验材料

3．2．2 实验试剂

3．2．3 实验仪器与设备

3．3 实验方法

3．3．1 黄酮类化合物的初步鉴定

3．3．2 喜盐草黄酮类化合物含量的测定

3．3．3 传统浸提工艺提取喜盐草黄酮类化合物的工艺研究

3．3．4 超声辅助提取喜盐草黄酮类化合物工艺的研究

3．3．5 纤维素酶辅助提取喜盐草黄酮工艺的研究

3．4 实验结果与讨论

3．4．1 黄酮的定性实验

3．4．2 喜盐草黄酮测量方法的考察

3．4．3 传统浸提工艺提取喜盐草黄酮类化合物的工艺研究

3．4．4 超声辅助提取喜盐草黄酮类化合物工艺的研究

3．4．5 纤维素酶辅助提取喜盐草黄酮类化合物工艺的研究

3．4．6 提取工艺最优组合的比较

4．喜盐草中黄酮类化合物的分离与纯化

4．1 引言

4．2 实验材料与试剂

4．2．1 实验材料

4．2．2 实验试剂

4．2．3 实验仪器与设备

4．3 实验方法

4．3．1 有机溶剂萃取法对喜盐草黄酮提取物的初步分离

4．3．2 喜盐草各萃取相中黄酮含量的测定

4．3．3 大孔吸附树脂选型及预处理

4．3．4 大孔吸附树脂的静态实验

4．3．5 不同条件下大孔吸附树脂对喜盐草黄酮样品纯化的影响

4．3．6 工艺验证

4．3．7 喜盐草正丁醇相经大孔树脂初步纯化物的HPLC分析

4．4 实验结果

4．4．1 各萃取相中的黄酮含量和紫外吸收扫描图

4．4．2 大孔吸附树脂的筛选

4．4．3 不同条件下大孔吸附树脂对喜盐草黄酮样品纯化的影响

4．4．4 工艺验证实验

4．4．5 初步纯化后喜盐草黄酮的HPLC分析

4．4．6 质谱分析

5 喜盐草中黄酮的抗氧化活性研究

5．1 引言

5．2 实验材料与试剂

5．2．1 实验材料

5．2．2 实验试剂

5．2．3 实验仪器与设备

5．3 实验方法

5．3．1 喜盐草黄酮总还原能力的测定

5．3．2 清除羟基自由基能力的测定

5．3．3 清除超氧阴离子自由基的能力的测定

5．3．4 清除DPPH自由基的能力的测定

5．3．5 清除亚硝基离子能力的测定

5．4 结果与分析

5．4．1 总还原力的测定

5．4．2 清除羟基自由基能力的测定

5．4．3 清除超氧阴离子自由基能力的测定

5．4．4 清除DPPH自由基的能力的测定

5．4．5 清除亚硝基离子能力的测定

6．总结和展望

参考文献

附录

致谢

个人简历

研究生期间发表的研究成果